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背景：白癜风是因黑素细胞被破坏，局部或全身形成白斑的一种多发、难治性皮肤病。该病严重影响患者的容貌和心理的健康。目前认为白癜风是在特殊遗传背景下，氧化应激等外界因素启动了针对黑素细胞的免疫反应，导致黑素细胞损伤/凋亡和局部白斑形成。然而氧化应激如何启动自身免疫这一关键机制尚待阐明。既往研究表明，CD8+T细胞介导的毒性杀伤作用是最终导致白癜风黑素细胞破坏的关键效应环节，表皮角质形成细胞分泌的多种趋化因子/细胞因子是介导免疫细胞向皮肤迁移及维持免疫应答的先决条件，但在白癜风皮损中趋化因子产生的机制并不明确。高迁移率族蛋白1(High mobile group box 1 protein，HMGB1)是损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMPs)家族重要的成员之一，是机体代谢过程中细胞损伤(如缺氧、氧化应激、损伤)后所释放的内源性危险信号。HMGB1的大量释放，可以通过识别受体激活相关信号通路导致趋化因子释放增加，从而招募更多的炎性细胞引起免疫原性凋亡。但HMGB1在白癜风发病中的免疫调控作用尚不清楚。
目的：
1.明确氧化应激条件下，白癜风皮损局部HMGB1的主要来源细胞类型。
2.探讨白癜风皮损局部HMGB1对角质形成细胞分泌趋化因子的调控作用以及相关分子机制。
3.验证HMGB1促进趋化因子产生对CD8+T细胞的趋化作用。
4.探讨HMGB1对抗原提呈细胞的活化作用。
方法：
1.收集白癜风患者及年龄、性别相匹配的正常人外周血，通过ELISA检测血清中HMGB1的水平差异，根据患者不同分期，分析HMGB1外周血水平与患者疾病进展期的相关性；收集患者皮损及健康对照皮肤组织，通过免疫荧光检测melan-A标记的黑素细胞中HMGB1的表达，对比HMGB1在正常健康黑素细胞及白癜风患者皮损周黑素细胞中的表达差异，并进行量化分析。
2.利用H2O2分别处理原代黑素细胞、角质形成细胞、正常人来源的黑素细胞系PIG1以及正常人来源角质形成细胞系HaCat，通过RT-PCR和Westernblot方法检测H2O2模拟的氧化应激条件下，HMGB1的mRNA表达水平及总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白表达水平；通过ELISA检测H2O2处理后的细胞上清中分泌的HMGB1水平。
3.利用重组人HMGB1刺激原代角质形成细胞及角质形成细胞系HaCat细胞，通过RT-PCR检测rhHMGB1对角质形成细胞趋化因子mRNA表达的影响；通过ELISA检测rhHMGB1对角质形成细胞趋化因子分泌水平的影响；收集H2O2处理过的原代黑素细胞上清，用以刺激原代角质形成细胞，通过ELISA检测H2O2处理黑素细胞上清中HMGB1对角质形成细胞分泌趋化因子的作用，并进行统计学分析。
4.分别在白癜风皮损组织及原代角质形成细胞中，通过免疫荧光检测HMGB1的三个主要受体Toll-样受体2、Toll-样受体4及糖基化终末产物受体RAGE在表皮及角质形成细胞中的表达；通过siRNA干涉主要受体RAGE，以Westernblot确定干涉效率，后经ELISA检测受体干涉后，rhHMGB1促进角质形成细胞趋化因子产生的水平，以明确rhHMGB1促进角质形成细胞分泌趋化因子的作用受体。
5.角质形成细胞系HaCat经rhHMGB1刺激后，通过Westernblot检测下游信号通路的活化，包括JNK、ERK、p38及NF-κB等信号通路；通过干涉RAGE后检测下游信号通路活化情况，通过干涉活化的信号通路检测趋化因子分泌情况，明确rhHMGB1促进角质形成细胞分泌趋化因子的信号转导通路。
6.收集白癜风患者外周PBMC，分离CD8+T细胞，通过transwell实验验证HMGB1诱导角质形成细胞分泌的趋化因子对CD8+T细胞迁移；收集白癜风患者及相匹配的正常人的血清，通过ELISA检测其中趋化因子的含量，并分析血清中HMGB1和趋化因子水平的相关性。
7.收集白癜风患者皮损组织，通过免疫荧光检测皮下浸润淋巴细胞中CD11c+DC细胞中HMGB1受体TLR2、TLR4及RAGE的表达情况。收集白癜风患者外周血，用H2O2处理的黑素细胞上清刺激外周血，通过流式细胞术检测其中DC细胞的成熟分子标记HLA-DR、CD80、CD86的表达水平；通过加入HMGB1中和抗体回复验证，明确HMGB1促进DC细胞成熟的作用。
结果及意义：
1.与正常的健康对照相比，白癜风患者外周血中HMGB1水平显著升高，将患者分为缓慢进展期与快速进展期，发现缓慢进展期相比正常对照组，HMGB1水平有升高趋势，但并无统计学差异，而快速进展期患者外周血HMGB1水平则显著高于健康对照及缓慢进展期患者；白癜风患者皮损残留黑素细胞中HMGB1大量分布在细胞浆，而正常黑素细胞中，HMGB1均存在细胞核；提示白癜风患者皮损处黑素细胞存在HMGB1从胞核转移到胞浆的现象。
2.H2O2处理原代黑素细胞及原代角质形成细胞后，黑素细胞中HMGB1的mRNA水平、总蛋白水平均显著上调；但在相同条件下，角质形成细胞中HMGB1表达水平无明显变化，提示氧化应激条件下，HMGB1的主要来源是黑素细胞；进一步分离黑素细胞胞浆和胞核，发现氧化应激诱导黑素细胞中HMGB1从胞核转移至胞浆；通过ELISA检测细胞培养上清中HMGB1水平，发现随H2O2处理时间延长，细胞培养上清中HMGB1分泌水平显著升高；免疫荧光结果同样观察到在H2O2处理后的不同时间点，HMGB1从细胞核转移到细胞浆。证实氧化应激条件下，黑素细胞是组织局部HMGB1的主要来源。
3.rhHMGB1处理的条件下，角质形成细胞中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL16、IL-6和IL-8的mRNA水平均显著升高；ELISA结果显示，rhHMGB1刺激的角质形成细胞培养上清中仅趋化因子CXCL16和IL-8水平显著升高。H2O2刺激的黑素细胞上清，与rhHMGB1一样，可以促进角质形成细胞分泌趋化因子CXCL16和IL-8，这一作用在加入HMGB1中和抗体后得到明显抑制，说明H2O2刺激的黑素细胞释放的HMGB1能够促进原代角质形成细胞释放趋化因子。
4.白癜风患者皮损组织中HMGB1的受体RAGE呈显著高表达；体外实验中，rhHMGB1刺激的角质形成细胞RAGE表达也明显升高；此外，干涉受体RAGE，rhHMGB1诱导角质形成细胞分泌趋化因子CXCL16和IL-8的水平均显著下调；说明HMGB1通过与受体RAGE结合，诱导角质形成细胞产生趋化因子。
5.rhHMGB1刺激角质形成细胞可显著活化细胞内NF-κB和ERK信号通路，通过干涉NF-κB或ERK信号通路，rhHMGB1诱导角质形成细胞产生趋化因子CXCL16和IL-8的水平显著降低，证实rhHMGB1可通过NF-κB和ERK信号通路调控趋化因子CXCL16和IL-8的分泌。
6.收集白癜风患者外周血，流式分选CD8+T细胞，transwell实验发现，氧化应激处理的黑素细胞上清，再次处理角质形成细胞，产生的细胞上清可显著诱导CD8+T细胞的趋化，如果在其中加入CXCL16的中和抗体，则趋化的CD8+T细胞数量明显减少，但是加入IL-8的中和抗体，则趋化CD8+T细胞的数量无明显变化，说明HMGB1诱导角质形成细胞分泌的趋化因子CXCL16可以促进CD8+T细胞的迁移。
7.选取进展期白癜风患者皮损组织，免疫荧光观察到皮损局部浸润DC细胞表面存在HMGB1的受体RAGE、TLR2和TLR4的表达，提示HMGB1可能通过与这些受体相互作用，调控DC细胞的生物学功能。
8.用rhHMGB1、氧化应激处理的黑素细胞上清进一步刺激白癜风患者外周血，流式分析其中DC细胞的活化标志分子表达水平，结果显示，HMGB1可显著促进DC细胞表达成熟分子CD80、CD86及HLA-DR，在上清中加入HMGB1的中和抗体，则DC细胞成熟标志分子CD80、CD86及HLA-DR的表达与对照组无明显差异，说明氧化应激诱导黑素细胞产生的HMGB1可以促进白癜风DC细胞成熟。
结论：
本研究首次明确了HMGB1在白癜风氧化应激诱导自身免疫发病中的作用和机制。本研究发现：相同的氧化应激条件下，黑素细胞对氧化应激更为敏感，因此低氧化应激条件下，黑素细胞首先释放HMGB1，释放到细胞外的HMGB1可改变白癜风皮损局部微环境，通过与角质形成细胞上受体RAGE结合，激活NF-κB和ERK信号通路，促进趋化因子CXCL18和细胞因子IL-8的表达和释放；其中趋化因子CXCL16可促进白癜风患者CD8+T细胞的迁移；此外，HMGB1通过与DC细胞表面受体结合，促进白癜风患者DC细胞的成熟与活化，增强抗原提呈功能。本研究阐明了氧化应激条件下，HMGB1促进趋化因子产生进而调控CD8+T细胞迁移和DC细胞抗原提呈功能的机制，解释了白癜风发病过程中，氧化应激如何启动自身免疫应答这一关键问题，该结果有助于深入理解氧化应激诱导自身免疫反应的发病机制，为白癜风治疗提供了全新思路和关键靶点。
目的：
1.明确氧化应激条件下，白癜风皮损局部HMGB1的主要来源细胞类型。
2.探讨白癜风皮损局部HMGB1对角质形成细胞分泌趋化因子的调控作用以及相关分子机制。
3.验证HMGB1促进趋化因子产生对CD8+T细胞的趋化作用。
4.探讨HMGB1对抗原提呈细胞的活化作用。
方法：
1.收集白癜风患者及年龄、性别相匹配的正常人外周血，通过ELISA检测血清中HMGB1的水平差异，根据患者不同分期，分析HMGB1外周血水平与患者疾病进展期的相关性；收集患者皮损及健康对照皮肤组织，通过免疫荧光检测melan-A标记的黑素细胞中HMGB1的表达，对比HMGB1在正常健康黑素细胞及白癜风患者皮损周黑素细胞中的表达差异，并进行量化分析。
2.利用H2O2分别处理原代黑素细胞、角质形成细胞、正常人来源的黑素细胞系PIG1以及正常人来源角质形成细胞系HaCat，通过RT-PCR和Westernblot方法检测H2O2模拟的氧化应激条件下，HMGB1的mRNA表达水平及总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白表达水平；通过ELISA检测H2O2处理后的细胞上清中分泌的HMGB1水平。
3.利用重组人HMGB1刺激原代角质形成细胞及角质形成细胞系HaCat细胞，通过RT-PCR检测rhHMGB1对角质形成细胞趋化因子mRNA表达的影响；通过ELISA检测rhHMGB1对角质形成细胞趋化因子分泌水平的影响；收集H2O2处理过的原代黑素细胞上清，用以刺激原代角质形成细胞，通过ELISA检测H2O2处理黑素细胞上清中HMGB1对角质形成细胞分泌趋化因子的作用，并进行统计学分析。
4.分别在白癜风皮损组织及原代角质形成细胞中，通过免疫荧光检测HMGB1的三个主要受体Toll-样受体2、Toll-样受体4及糖基化终末产物受体RAGE在表皮及角质形成细胞中的表达；通过siRNA干涉主要受体RAGE，以Westernblot确定干涉效率，后经ELISA检测受体干涉后，rhHMGB1促进角质形成细胞趋化因子产生的水平，以明确rhHMGB1促进角质形成细胞分泌趋化因子的作用受体。
5.角质形成细胞系HaCat经rhHMGB1刺激后，通过Westernblot检测下游信号通路的活化，包括JNK、ERK、p38及NF-κB等信号通路；通过干涉RAGE后检测下游信号通路活化情况，通过干涉活化的信号通路检测趋化因子分泌情况，明确rhHMGB1促进角质形成细胞分泌趋化因子的信号转导通路。
6.收集白癜风患者外周PBMC，分离CD8+T细胞，通过transwell实验验证HMGB1诱导角质形成细胞分泌的趋化因子对CD8+T细胞迁移；收集白癜风患者及相匹配的正常人的血清，通过ELISA检测其中趋化因子的含量，并分析血清中HMGB1和趋化因子水平的相关性。
7.收集白癜风患者皮损组织，通过免疫荧光检测皮下浸润淋巴细胞中CD11c+DC细胞中HMGB1受体TLR2、TLR4及RAGE的表达情况。收集白癜风患者外周血，用H2O2处理的黑素细胞上清刺激外周血，通过流式细胞术检测其中DC细胞的成熟分子标记HLA-DR、CD80、CD86的表达水平；通过加入HMGB1中和抗体回复验证，明确HMGB1促进DC细胞成熟的作用。
结果及意义：
1.与正常的健康对照相比，白癜风患者外周血中HMGB1水平显著升高，将患者分为缓慢进展期与快速进展期，发现缓慢进展期相比正常对照组，HMGB1水平有升高趋势，但并无统计学差异，而快速进展期患者外周血HMGB1水平则显著高于健康对照及缓慢进展期患者；白癜风患者皮损残留黑素细胞中HMGB1大量分布在细胞浆，而正常黑素细胞中，HMGB1均存在细胞核；提示白癜风患者皮损处黑素细胞存在HMGB1从胞核转移到胞浆的现象。
2.H2O2处理原代黑素细胞及原代角质形成细胞后，黑素细胞中HMGB1的mRNA水平、总蛋白水平均显著上调；但在相同条件下，角质形成细胞中HMGB1表达水平无明显变化，提示氧化应激条件下，HMGB1的主要来源是黑素细胞；进一步分离黑素细胞胞浆和胞核，发现氧化应激诱导黑素细胞中HMGB1从胞核转移至胞浆；通过ELISA检测细胞培养上清中HMGB1水平，发现随H2O2处理时间延长，细胞培养上清中HMGB1分泌水平显著升高；免疫荧光结果同样观察到在H2O2处理后的不同时间点，HMGB1从细胞核转移到细胞浆。证实氧化应激条件下，黑素细胞是组织局部HMGB1的主要来源。
3.rhHMGB1处理的条件下，角质形成细胞中CXCL9、CXCL10、CXCL11及CXCL16、IL-6和IL-8的mRNA水平均显著升高；ELISA结果显示，rhHMGB1刺激的角质形成细胞培养上清中仅趋化因子CXCL16和IL-8水平显著升高。H2O2刺激的黑素细胞上清，与rhHMGB1一样，可以促进角质形成细胞分泌趋化因子CXCL16和IL-8，这一作用在加入HMGB1中和抗体后得到明显抑制，说明H2O2刺激的黑素细胞释放的HMGB1能够促进原代角质形成细胞释放趋化因子。
4.白癜风患者皮损组织中HMGB1的受体RAGE呈显著高表达；体外实验中，rhHMGB1刺激的角质形成细胞RAGE表达也明显升高；此外，干涉受体RAGE，rhHMGB1诱导角质形成细胞分泌趋化因子CXCL16和IL-8的水平均显著下调；说明HMGB1通过与受体RAGE结合，诱导角质形成细胞产生趋化因子。
5.rhHMGB1刺激角质形成细胞可显著活化细胞内NF-κB和ERK信号通路，通过干涉NF-κB或ERK信号通路，rhHMGB1诱导角质形成细胞产生趋化因子CXCL16和IL-8的水平显著降低，证实rhHMGB1可通过NF-κB和ERK信号通路调控趋化因子CXCL16和IL-8的分泌。
6.收集白癜风患者外周血，流式分选CD8+T细胞，transwell实验发现，氧化应激处理的黑素细胞上清，再次处理角质形成细胞，产生的细胞上清可显著诱导CD8+T细胞的趋化，如果在其中加入CXCL16的中和抗体，则趋化的CD8+T细胞数量明显减少，但是加入IL-8的中和抗体，则趋化CD8+T细胞的数量无明显变化，说明HMGB1诱导角质形成细胞分泌的趋化因子CXCL16可以促进CD8+T细胞的迁移。
7.选取进展期白癜风患者皮损组织，免疫荧光观察到皮损局部浸润DC细胞表面存在HMGB1的受体RAGE、TLR2和TLR4的表达，提示HMGB1可能通过与这些受体相互作用，调控DC细胞的生物学功能。
8.用rhHMGB1、氧化应激处理的黑素细胞上清进一步刺激白癜风患者外周血，流式分析其中DC细胞的活化标志分子表达水平，结果显示，HMGB1可显著促进DC细胞表达成熟分子CD80、CD86及HLA-DR，在上清中加入HMGB1的中和抗体，则DC细胞成熟标志分子CD80、CD86及HLA-DR的表达与对照组无明显差异，说明氧化应激诱导黑素细胞产生的HMGB1可以促进白癜风DC细胞成熟。
结论：
本研究首次明确了HMGB1在白癜风氧化应激诱导自身免疫发病中的作用和机制。本研究发现：相同的氧化应激条件下，黑素细胞对氧化应激更为敏感，因此低氧化应激条件下，黑素细胞首先释放HMGB1，释放到细胞外的HMGB1可改变白癜风皮损局部微环境，通过与角质形成细胞上受体RAGE结合，激活NF-κB和ERK信号通路，促进趋化因子CXCL18和细胞因子IL-8的表达和释放；其中趋化因子CXCL16可促进白癜风患者CD8+T细胞的迁移；此外，HMGB1通过与DC细胞表面受体结合，促进白癜风患者DC细胞的成熟与活化，增强抗原提呈功能。本研究阐明了氧化应激条件下，HMGB1促进趋化因子产生进而调控CD8+T细胞迁移和DC细胞抗原提呈功能的机制，解释了白癜风发病过程中，氧化应激如何启动自身免疫应答这一关键问题，该结果有助于深入理解氧化应激诱导自身免疫反应的发病机制，为白癜风治疗提供了全新思路和关键靶点。