目的:肝癌是目前世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一,现有的手术和化疗等治疗手段效果并不明显,亟待研发新的肝癌治疗方法和药物。6-姜烯酚（6-Shogaol）是生姜中的主要活性成分之一,其在干姜中的含量相对较高,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用,尤其是在抗肿瘤方面对多种肿瘤如结肠癌、胃癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等均有抑制作用。但由于6-姜烯酚在姜中含量极低,且很多分子结构类似的化合物会对其提取、纯化和分离过程形成干扰,导致制备难度较大、效率不高。目前在6-姜烯酚的抗肝癌方面研究报道较少,与化疗药物联合用药抗肝癌作用的研究暂时未见报道,对于抗肝癌的作用机制研究还不够深入,并且因其水难溶性,不利于制剂和临床应用。针对以上问题,本课题首先将闪式提取法与高速逆流色谱法相结合,构建一种高效制备6-姜烯酚的方法,再对6-姜烯酚的抗肝癌作用及其与化疗药物的协同增效作用进行深入研究,并从细胞和分子层面解释其作用机制,最后利用纳米技术制备纳米乳用于搭载6-姜烯酚,解决其溶解度低的问题,并研究6-姜烯酚纳米乳的抗肝癌效果,旨在推进该成分及其在姜类中药中的抗肝癌作用研究,为治疗肝癌及辅助化疗的新药研发和临床应用提供必要的依据。方法:1.6-姜烯酚含量测定分析方法的建立;分别利用闪式提取法和加热回流提取法提取不同产地干姜中的6-姜烯酚,比较两种提取方法的优劣和不同产地干姜中6-姜烯酚的含量;采用单因素考察法,分别考察乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间对6-姜烯酚提取的影响;利用正交实验设计优化6-姜烯酚的提取工艺条件;采用乙酸乙酯萃取法纯化6-姜烯酚粗提物,利用薄层色谱法（TLC）筛选溶剂系统,将纯化后的6-姜烯酚提取物进高速逆流色谱仪分离目标化合物;采用液质联用（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR）对分离出的目标化合物进行分子量测定和结构解析,并以标准品为对照,HPLC法测定分离出的目标化合物纯度,为后续制剂研究提供原料。2.以Bel-7402和HepG2肝癌细胞为研究对象,利用MTT法检测不同药物浓度下6-姜烯酚对肝癌细胞活力的影响;利用Brd U染色法和Annexin V-FITC/PI双染色法,考察6-姜烯酚对肝癌细胞增殖和凋亡的影响;采用qRT–PCR法和Western blotting法,考察不同浓度6-姜烯酚对肝癌细胞TLR4、FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响;通过慢病毒感染与细胞转染实验,构建TLR4和FOXO3a基因过表达肝癌细胞模型,利用MTT法、Brd U染色法、q RT–PCR法、Western blotting法和Annexin V-FITC/PI双染色法,考察6-姜烯酚对过表达TLR4肝癌细胞和同时过表达TLR4和FOXO3a肝癌细胞的增殖、凋亡以及细胞中TLR4、FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响;利用MTT法、Brd U染色法、q RT–PCR法、Western blotting法和Annexin V-FITC/PI双染色法,考察6-姜烯酚和SKL2001（Wnt/β-catenin通路激活剂）同时作用对肝癌细胞的增殖、凋亡以及细胞中FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响;以BALB/c裸鼠为实验对象,通过接种肝癌细胞（Bel-7402）或稳定表达TLR4的肝癌细胞（Bel-7402）制备肿瘤模型,考察31天后各给药组对肿瘤大小的影响,以及利用免疫组化（IHC）法和Western blotting法,考察不同给药组处理后对裸鼠肿瘤中Ki-67表达量,以及TLR4,Wnt1,β-catenin和FOXO3a蛋白表达量的影响。3.以HepG2和LI-7肝癌细胞为研究对象,利用MTT法、流式技术,考察6-姜烯酚联合5-FU对肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响;Western blotting法检测Cyclin A2、Cyclin D1和Cyclin E1等蛋白的表达,考察6-姜烯酚联合5-FU对肝癌细胞周期蛋白表达的影响;设置不同浓度的6-姜烯酚和5-FU,利用MTT法计算其单独作用与联合作用后的肝癌细胞存活率,计算联合指数（CI）值,考察6-姜烯酚与5-FU是否有协同效应;分别设置不同的给药组,利用MTT法、流式细胞术和Western blotting法,考察6-姜烯酚联合5-FU通过AKT/mTOR途径对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响;按慢病毒感染和转染操作方法,建立MRP1过表达的肝癌细胞模型,分别设置不同的给药组,利用MTT法、流式技术、q RT-PCR法和Western blotting法,考察6-姜烯酚联合5-FU通过MRP1途径对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响,以及6-姜烯酚联合5-FU通过调控AKT/mTOR/MRP1轴对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响;以BALB/c裸鼠为实验对象,通过接种肝癌细胞（HepG2）制备肿瘤模型,考察35天后各给药组对肿瘤大小的影响,以及利用免疫组化法和Western blotting法,考察不同给药组处理后对裸鼠肿瘤中MRP1的表达量,以及AKT,mTOR和MRP1蛋白表达量的影响。4.依据预实验研究结果,通过单因素实验法,以粒径为评价指标,分别考察油相用量、混合表面活性剂用量、超声时间和超声功率对空白纳米乳制备的影响;根据空白纳米乳的单因素处方筛选结果,选取对其影响较大的处方和工艺参数作为考察因素,选取成乳后的粒径及载药量作为响应值,采用星点设计-效应面法优化空白纳米乳处方,并根据实验结果确定载药量;通过观察处方量6-姜烯酚纳米乳的颜色和流动性,对其外观进行评价;通过马尔文激光粒度仪测定6-姜烯酚纳米乳的粒径和Zeta电位。在透射电镜下观察其形态,并用染色法鉴别其乳液类型;利用离心法测定6-姜烯酚纳米乳的包封率;采用透析法进行体外释药研究,并利用模拟方程对其体外释药行为进行分析;利用低温、室温和高温实验,以纳米乳的粒径和药物含量为指标,对所制备的6-姜烯酚纳米乳稳定性进行评价;以BALB/c裸鼠为实验对象,通过接种肝癌细胞（HepG2）制备肝癌肿瘤模型,考察35天后各给药组对肿瘤大小的影响,分析6-姜烯酚纳米乳的抗肝癌作用。结果:1.建立了6-姜烯酚的HPLC含量测定方法,在方法学考察中,专属性、线性、精密度、重复性、稳定性和加样回收实验均符合测定要求,所用方法能够快速准确的检测6-姜烯酚的含量;根据色谱条件测定不同提取方法下各产地提取物中6-姜烯酚的含量,结果显示,同一产地的干姜用两种不同方法提取6-姜烯酚,其提取量无明显差异,但闪式提取法所用提取时间更短。同种提取方法下,产地为山东省临沂市沂水县的干姜,其6-姜烯酚的提取量最大;闪式提取法的单因素考察结果显示,在一定范围内,乙醇浓度、料液比、提取次数和提取时间均会影响6-姜烯酚的提取量;利用正交设计实验得到的最优提取工艺为80%乙醇为提取溶剂,料液比为1:30,提取2次,每次提取1.5 min。对最优工艺的验证结果显示,6批样品的平均提取量为0.685±0.007,RSD为0.96%;利用高速逆流色谱法对6-姜烯酚的分离纯化结果显示,将6-姜烯酚用乙酸乙酯萃取后,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（10:5:10:5,v/v）为溶剂系统,经高速逆流色谱仪可分离出纯度较高的6-姜烯酚。所分离出的目标化合物经液质联用仪和核磁共振进行分子量推测及结构解析后,确定为6-姜烯酚。2.以Bel-7402和HepG2肝癌细胞为研究对象,6-姜烯酚对肝癌细胞增殖和凋亡的影响结果显示,6-姜烯酚以剂量依赖的方式降低肝癌细胞活力,抑制肝癌细胞的增殖,且40μM浓度下作用最为显著。而不同浓度的6-姜烯酚可使肝癌细胞凋亡率明显增加;6-姜烯酚对肝癌细胞TLR4、FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响结果显示,给药后,与正常肝细胞相比,TLR4基因在肝癌细胞中的表达明显上调,而FOXO3a基因的表达则下调。肝癌细胞中TLR4、Wnt1和β-catenin蛋白表达显著上调,而FOXO3a蛋白表达下调。6-姜烯酚对肝癌细胞TLR4、Wnt1和β-catenin基因或蛋白的表达均有明显的下调作用,且呈剂量依赖性。相比之下,肝癌细胞中的FOXO3a基因或蛋白被6-姜烯酚激活;6-姜烯酚对过表达TLR4肝癌细胞的增殖、凋亡以及细胞中TLR4、FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响结果显示,6-姜烯酚对TLR4和FOXO3a基因表达的影响被TLR4上调所逆转。在6-姜烯酚处理的肝癌细胞中,TLR4的过表达显著增加了TLR4、Wnt1和β-catenin蛋白的表达,抑制了FOXO3a蛋白的表达。此外,TLR4过表达可逆转6-姜烯酚对肝癌细胞增殖的抑制作用。TLR4的过表达抑制了6-姜烯酚对肝癌细胞的促凋亡作用;6-姜烯酚和SKL2001（Wnt/β-catenin通路激活剂）同时作用对肝癌细胞增殖、凋亡以及细胞中FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响结果显示,SKL2001激活了Wnt/β-catenin途径,并显著逆转了6-姜烯酚诱导的FOXO3a激活,SKL2001的存在回复了6-姜烯酚诱导的肝癌细胞增殖下降,而6-姜烯酚对肝癌细胞的促凋亡作用一直被SKL2001抑制;6-姜烯酚对同时过表达肝癌细胞的增殖、凋亡以及细胞中TLR4、FOXO3a、Wnt1和β-catenin基因或蛋白表达的影响结果显示,当6-姜烯酚处理TLR4过表达细胞时,FOXO3a基因在肝细胞中的表达显著下调,TLR4、Wnt1蛋白和β-catenin蛋白的表达被激活。过表达TLR4和FOXO3a后,FOXO3a的表达增加,而TLR4、Wnt1和β-catenin的蛋白表达没有变化。此外,FOXO3a过表达逆转了TLR4过表达对癌细胞增殖和凋亡的影响;动物体内实验结果显示,给药后,6-姜烯酚可显著抑制小鼠肝癌肿瘤的大小,而TLR4的过表达逆转了这一现象,6-姜烯酚可显著抑制小鼠肝癌组织细胞中Ki-67的表达,并可部分被TLR4过表达逆转。此外,6-姜烯酚可显著抑制小鼠肝癌组织中TLR4、WNT1和β-catenin蛋白的表达,上调FOXO3a蛋白的水平,但可被TLR4的过表达所逆转。3.以HepG2和LI-7肝癌细胞为研究对象,6-姜烯酚联合5-FU对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响结果显示,6-姜烯酚和5-FU对肝癌细胞活力有明显的抑制作用,并且50μM浓度的6-姜烯酚进一步增强了5-FU对细胞活力的抑制作用。不同浓度比下6-姜烯酚和5-FU联合作用的CI值均小于1,说明两药具有协同作用。与5-FU相比,6-姜烯酚联合5-FU能显著提高G0/G1期细胞百分率,降低S、G2/M期细胞百分率。6-姜烯酚和5-FU均可下调细胞周期相关蛋白（Cyclin A2、Cyclin D1和Cyclin E1）的表达,6-姜烯酚可增强5-FU对肝癌细胞周期的抑制作用。此外,研究结果还显示出在6-姜烯酚诱导下进一步增强了5-FU对肝癌细胞凋亡的促进作用;6-姜烯酚联合5-FU通过AKT/mTOR途径对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响结果显示,6-姜烯酚与5-FU联合作用后,进一步下调了AKT和mTOR的磷酸化水平。6-姜烯酚和5-FU联合处理显著降低了肝癌细胞中AKT和mTOR的磷酸化水平,AKT的激活可部分逆转这一作用。细胞活力分析显示,6-姜烯酚联合5-FU对肝癌细胞活力的抑制明显被AKT激活所逆转。6-姜烯酚和5-FU联合应用可显著上调G0/G1期细胞比例,下调S期和G2/M期细胞比例,但AKT的激活逆转了这一变化。SC79可部分逆转6-姜烯酚联合5-FU对Cyclin A2、Cyclin D1和Cyclin E1表达的抑制作用。此外,6-姜烯酚联合5-FU治疗可有效促进癌细胞凋亡,AKT激活可部分逆转这一作用;6-姜烯酚联合5-FU通过MRP1途径对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响结果显示,在6-姜烯酚和5-FU处理的细胞中,MRP1的m RNA和蛋白水平分别低于对照组,联合应用6-姜烯酚和5-FU可进一步降低MRP1水平。用SC79处理激活AKT/mTOR信号可有效得逆转6-姜烯酚和5-FU联合作用引起的MRP1水平下降。MRP1过表达载体转染细胞后,MRP1的m RNA和蛋白表达水平显著升高。6-姜烯酚和5-FU联合应用可显著抑制肝癌细胞的活性,这种抑制作用可通过增加MRP1而部分逆转。6-姜烯酚联合5-FU诱导肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期,可通过增加MRP1的表达来逆转,MRP1过表达可部分逆转6-Sho Goal联合5-FU对Cyclin A2、Cyclin D1和Cyclin E1表达的抑制作用。6-姜烯酚和5-FU联合作用可显著促进肝癌细胞的凋亡,而联合作用的促进作用可以通过增加MRP1的表达而部分逆转;6-姜烯酚联合5-FU通过调控AKT/mTOR/MRP1轴对肝癌细胞增殖、周期和凋亡的影响结果显示,6-姜烯酚和5-FU联合作用可显著降低肝癌细胞MRP1 m RNA的表达,这种作用可被AKT激活所逆转,并通过沉默MRP1得到了巩固。而在6-姜烯酚和5-FU共同处理的肝癌细胞中,沉默MRP1可有效地逆转AKT激活诱导的MRP1 m RNA增加。联合应用6-姜烯酚和5-FU可降低AKT和mTOR的磷酸化水平及MRP1蛋白的表达。此外,6-姜烯酚和5-FU共同处理的肝癌细胞后,沉默MRP1可减弱了SC79对肝癌细胞中MRP1表达的促进作用。细胞增殖实验表明,AKT的激活可显著促进6-姜烯酚和5-FU共同处理的肝癌细胞增殖,而MRP1基因敲除则抑制了细胞增殖。经流式细胞仪进行细胞周期分析后显示,AKT的激活显著减轻了6-姜烯酚和5-FU联合处理肝癌细胞引起的G0/G1期阻滞,MRP1沉默加剧了这种阻滞。在AKT激活后,Cyclin A2、Cyclin D1和Cyclin E1在肝癌细胞中的表达水平升高,MRP1沉默可部分逆转它们的表达。另外,联合应用6-姜烯酚和5-FU可明显促进癌细胞的凋亡,但AKT的激活可减少癌细胞的凋亡。然而,沉默MRP1有效地限制了SC79的作用,并促进了癌细胞的凋亡;动物体内实验结果显示,6-姜烯酚组和5-FU组的小鼠肝癌肿瘤体积均小于对照组。而与其他组的小鼠相比,接受6-姜烯酚和5-FU联合治疗的小鼠肿瘤体积和瘤重最小。6-姜烯酚和5-FU联用的药效明显好于单药,在抑制肝癌肿瘤形成方面表现出协同作用。经6-姜烯酚和5-FU处理的小鼠肿瘤中磷酸化AKT水平、磷酸化mTOR水平和MRP1表达均低于对照组。6-姜烯酚和5-FU联合治疗进一步降低了肿瘤中AKT和mTOR磷酸化以及MRP1的表达。利用免疫组化法对肿瘤组织中MRP1的表达进行检测,结果表明,经6-姜烯酚和5-FU处理后,抑制了肿瘤组织中MRP1的表达,将两药联合作用后进一步下调了MRP1的表达。4.空白纳米乳制备工艺的单因素考察结果显示,除超声时间外,油相用量、混合乳化剂用量和超声功率均在一定范围内对空白纳米乳的粒径有显著影响;根据星点设计-效应面法优选出的工艺条件为:油相用量（10%）、混合乳化剂用量（20%）、超声功率（300 W）。对最优处方进行验证,结果显示,预测值与真实值偏差较小,表明所用的星点设计-效应面优化法具有良好的预测效果;根据最优处方确定最优工艺下所制备的纳米乳对6-姜烯酚的理论载药量为36.30 mg·g-1,考虑到整个载药体系的稳定性,实际载药量为30 mg·g-1;室温条件下,所制备的6-姜烯酚纳米乳为淡黄色液体,流动性较好。而在4℃条件下,6-姜烯酚纳米乳流动性有所下降,其他无明显变化;通过马尔文激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位,结果显示,所制备的6-姜烯酚纳米乳平均粒径为38.03±1.92 nm,PDI为0.14±0.06,Zeta电位为-19.06±0.25 m V;6-姜烯酚纳米乳在透射电镜下观察其形态呈圆球型,大小及分布均匀,粒径在30～45 nm之间;染色法鉴别6-姜烯酚纳米乳为O/W型;离心法测定包封率结果显示,6-姜烯酚纳米乳具有较高的的包封率,平均包封率达到97.26%;6-姜烯酚纳米乳的体外释药研究结果显示,0.5 h时,6-姜烯酚纳米乳和6-姜烯酚原料药的药物累积释放量分别为38.12%和18.33%。4 h时,6-姜烯酚纳米乳的药物累积释放量达到了85%以上,而6-姜烯酚原料药24 h时的最终药物累积释放量仅为60.42%。对释药曲线进行拟合后发现,6-姜烯酚原料药的体外释药符合一级动力学方程,而6-姜烯酚纳米乳的体外释药符合Higuchi方程;稳定性研究结果显示,在30天内,6-姜烯酚纳米乳在4℃冰箱中,除流动性较25℃、40℃条件下会变差外,其他无明显变化。三种温度环境下,与第0天相比较,40℃条件下粒径变化明显,4℃和25℃条件下无明显变化。30天后三种温度条件下的药物含量会略有下降,总体稳定性良好;6-姜烯酚纳米乳抗小鼠肝细胞癌的作用结果显示,与对照组相比,6-姜烯酚组、6-姜烯酚纳米乳联合5-FU组均能显著抑制小鼠肿瘤的生长,而与6-姜烯酚组相比,6-姜烯酚纳米乳组的抗肝癌效果要更强。结论:本研究利用闪式提取技术,结合高速逆流色谱技术,从干姜中高效制备了纯度较高的6-姜烯酚。在体外和体内研究中,6-姜烯酚可下调TLR4在肝癌细胞中的表达,介导Wnt/β-catenin信号通路,上调FOXO3a来抑制肝癌的发展。6-姜烯酚与5-FU之间具有协同增效的作用,6-姜烯酚可通过抑制AKT/mTOR/MRP1信号通路而有效提高5-FU治疗肝癌的效果。通过单因素实验和星点设计-效应面法对空白纳米乳的制备工艺进行优化,成功制备了载药量高、包封率高、释药速度快、粒径小于100 nm、外观性质和稳定性均较好的6-姜烯酚纳米乳,与6-姜烯酚原料药相比,其具有更强的抗肝癌作用。