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为了了解植物叶片衰老过程中细胞内蛋白质降解和蛋白水解酶的变化行为，本论文对小麦(Triticum aestivum L. cv．Yanmai 158)叶片衰老过程中内肽酶同工酶的变化和特性以及Rubisco在叶衰老过程中的降解进行了研究。主要研究内容如下： 1、小麦叶片衰老过程中内肽酶的变化 蛋白质的降解需要蛋白水解酶，包括内肽酶和外肽酶的参与，叶衰老过程中发挥主要作用的是内肽酶。小麦叶片暗诱导衰老和自然衰老过程中，内肽酶活力均先上升后下降，这一过程伴随着内肽酶同工酶谱的变化。采用多种改进的内肽酶同工酶梯度凝胶电泳方法，检测到多种在衰老期间表达的内肽酶同工酶，当以血红蛋白为底物时，在暗诱导衰老过程中先后出现4种新的内肽酶，而在自然衰老过程中先后出现5种新的内肽酶，有一种只在自然衰老过程中才检测到，而且一些原来就存在的内肽酶同工酶活力也发生变化。当以明胶为底物时，衰老过程中主要检测到5种新的内肽酶同工酶，它们在自然衰老过程中也能检测到，并且以明胶为底物所得的内肽酶同工酶谱与以植物蛋白Rubisco为底物所得的同工酶谱比较接近。而采用将明胶为底物的SDS-PAGE方法只能检测到一种新内肽酶同工酶的出现，因此衰老期间表达的内肽酶同工酶大都是对SDS敏感的或多亚基的蛋白水解酶。另外，采用不同的内肽酶同工酶电泳方法研究中均发现自然衰老和暗诱导衰老过程中的内肽酶同工酶谱变化基本相似，因此暗诱导衰老可以作为一种研究叶片自然衰老过程中出现的蛋白水解酶的特性的模式。 2、叶衰老过程中内肽酶的特性研究 采用明胶为底物的梯度凝胶电泳方法研究小麦叶片内衰老相关性蛋白水解酶的表达和生化特性发现，衰老相关性蛋白酶的表达由核基因控制，外源激素处理也影响这些蛋白酶的表达，如6-BA(6-苄氨基嘌呤)能延缓这些同工酶的出现，而ABA(脱落南京农业大学博士学位论文小麦叶片衰老过程中内肤酶同工酶变化与特性及Rubisc。降解的研究酸)则加速它们的表达.衰老期间的6种主要的内肤酶同工酶(EPI一P6)中，EPI、EPZ、EP4、EPS、EP6是衰老期间才表达的，它们呈现活力的pH范围及温度范围较窄;EP3不是到衰老期间才表达的，但它在叶衰老过程中活性增强，其表现活力的pH范围和温度范围均较宽.另外，EP3、EPS、EP6对热不太敏感，EPI、EPZ、EP4对热相对较敏感.加入不同蛋白酶抑制剂处理的实验结果表明，EPI、EPZ是需金属离子的半脱氨酸型内肤酶，EP4是丝氨酸型内肤酶，EPS和EP6的活力能被丝氨酸型蛋白酶抑制剂部分抑制，而选用的几种抑制剂对EP3都没有明显的抑制效果。 3、小麦叶片衰老过程中1，5一二磷酸核酮糖数化酶伽氧酶(RubiscoEC 4.1.1.39)的降解 小麦叶片暗诱导衰老和自然衰老过程中，Rubisc。大亚基(LSU)发生裂解，产生50叨的降解产物，这是首次在叶衰老过程中检测到Rubisco的体内(in vivo)降解产物.进一步的研究发现LSU发生这步裂解时，Ruhisco全酶没有解离，SOkD降解产物仍能组装在Rubisco全酶中.当以幼嫩叶片的粗酶液为研究体系时，在pH为5.5，温度为30一35℃时也能检测到LSU裂解产生的SOkD的降解产物;而以衰老叶片的粗酶液为研究体系时，在pH7.5时能检测到反应明显发生，反应的温度也为30一35℃.从幼嫩叶片中提取的叶绿体，在pHS.5和7.5的条件下均不能产生50kD的降解产物;而从衰老叶片提取的叶绿体，在酸性条件下该反应不能进行，但在pH7.5时则能检测到有SOkD降解产物的出现.抑制剂实验还表明，不管是在幼嫩叶片还是衰老叶片中，Lsu由5 3kD降解为50kD这一反应都能被半脱氛酸型蛋白酶抑制R.JE一64和leuPePtin抑制，同时，金属蛋白酶抑制剂能部分抑制该反应.对50kD降解条带N一末端测序发现降解位点是LSU第14号氨基酸赖氨酸残基和第巧号氨基酸丙氨酸残基之间的肤健，该位点位于Rublsco分子中LSU与LSU、LSU与SSU相互作用的区域. 以上研究结果有助于更全面地了解植物体内的蛋白质降解和蛋白水解酶，有助于阐明叶衰老过程中Rubisco快速降解的分子机制，丰富生物体内蛋白质降解理论;而且能为从分子水平上改造Rubisco，调控其活性和降解，并为发现新的蛋白水解酶提供线索;同时还能为今后农业生产实践上延缓作物衰老，提高作物产量和品质提供科学依据.