帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种多发于中老年的神经退行性疾病,发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）。其病理特征是黑质（substantia nigra,SN）多巴胺能神经元的脱失、残存神经元内出现路易小体、纹状体（striatum,Str）中的多巴胺（dopamine,DA）含量显著减少。PD主要的临床表现有以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征的运动症状和自主神经功能障碍、感觉障碍、睡眠障碍和精神认知障碍等非运动症状。据《中国帕金森病治疗指南（第三版）》报道,我国60岁以上人群PD的患病率大约是1.7%,目前患病人数约270万。世界卫生组织专家预测,预计到2030年中国PD患者的人数将达到500万。因此,无论是从社会学角度还是经济学角度,PD已经成为影响我国人口健康水平和生活质量、严重阻碍经济持续发展的重大社会问题。PD的发病受环境和遗传因素的影响,其具体发病机制未完全明确,已知与炎症、氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能受损等有关。因此,深入探讨PD的发病机制,并针对发病分子机制寻找新的防治靶点,以能够逆转或阻止疾病的进展势在必行。乳铁蛋白（lactoferrin,Lf）属于转铁蛋白家族的非血红素铁结合糖蛋白,Lf结合Fe³⁺通过乳铁蛋白受体（lactoferrin receptor,LfR）介导的细胞内吞途径进入细胞,并可以通过血脑屏障（blood brain barrier,BBB）进入脑内。Lf主要以两种形式存在:不含铁形式（apo-lactoferrin,apo-Lf）和铁饱和形式（holo-lactoferrin,holo-Lf）。Lf对铁的亲和力是转铁蛋白的300多倍,在酸性环境中的亲和力会显著增加。Lf在包括铁代谢、免疫调节、抗凋亡和抗氧化等在内的多种生物学功能中起着重要的作用。Lf在脑中由激活的小胶质细胞合成和释放,apo-Lf是小胶质细胞释放的主要形式。继Dexter DT等人首次在PD患者发现铁水平升高以来,大量研究均发现PD患者和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）以及6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的PD动物模型SN中铁水平增加,因为铁通过催化Feton反应形成高毒性羟基自由基,通过氧化应激导致细胞损伤,因此脑铁代谢功能障碍在PD的发病机制中发挥关键作用。另有研究发现在PD病人和MPTP诱导的PD动物模型SN神经元中可见Lf和LfR表达增加。Lf在脑中主要由激活的小胶质细胞合成并分泌。我们实验室之前的研究观察到活化的小胶质细胞可以合成和释放Lf,铁过载进一步增强了这一过程。在腹侧中脑（ventral mesencephalon,VM）神经元离体实验中,apo-Lf和holo-Lf通过保护线粒体,增加铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase,Cu/Zn-SOD）和B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）的蛋白表达,对抗1-甲基-4-苯基吡啶（1-Methyl-4-phenylpyridine,MPP⁺）以发挥其神经保护作用。表明Lf能够保护神经毒素处理的多巴胺能神经元,该保护作用可能与apo-Lf和holo-Lf的抗氧化和抗细胞凋亡活性有关。本研究旨在通过在体实验进一步观察两种不同形式的Lf是否有神经保护效应并探讨其中枢和外周机制,从而为找到PD新的潜在防治靶点提供实验依据。本研究将9-10周龄,体重20-30g的雄性C57BL/6小鼠采用完全随机分组方法分为10组,腹腔注射MPTP 5天,产生亚急性MPTP小鼠模型。分别是:对照组、MPTP组、Lf预处理组（MPTP+15mg/kg holo-Lf、MPTP+10mg/kg holo-Lf、MPTP+5mg/kg holo-Lf、MPTP+10mg/kg apo-Lf、MPTP+5mg/kg apo-Lf）和Lf组（15mg/kg holo-Lf、10mg/kg holo-Lf、10mg/kg apo-Lf）。采用免疫组织化学、免疫荧光、行为学方法、蛋白质免疫印迹（Western Blot）、高效液相色谱（HPLC）、普鲁士蓝染色方法、酶联免疫吸附法（ELISA）、紫外比色法和血液常规检查方法观察SN中LfR的表达、酪氨酸羟化酶免疫反应阳性（TH-ir）神经元的数量变化、Str中DA及其代谢产物二羟苯乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的含量变化、SN中铁染色阳性神经元的变化、小鼠肢体运动协调能力的改变、单胺氧化酶B（MAO-B）在脑中和外周血中的含量变化、SN中DMT1和FPN1的表达变化、SN中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、Cu/Zn-SOD、CD86蛋白的水平变化、肝脏和脾脏中铁水平的变化、血清铁和血清铁蛋白以及总铁结合力（TIBC）的变化、红细胞和血红蛋白相关指标的变化情况,以探讨Lf对MPTP诱导的PD小鼠的神经保护作用及其可能的中枢和外周机制。具体结果如下:1.Lf对MPTP诱导的PD小鼠的神经保护作用研究（1）Lf灌胃给药引起SN中LfR表达增加。与对照组相比,MPTP处理、Lf预处理和单独给予Lf各组均发现SN中LfR的表达增加（P<0.05,n=6）。（2）Lf预处理减少MPTP导致的SN中TH-ir神经元丢失。与对照组相比,MPTP能够引起SN中TH-ir神经元显著丢失。用高剂量Lf（15mg/Kg holo-Lf和10mg/Kg apo-Lf）预处理可以减少由MPTP导致的TH-ir神经元丢失（P<0.05,n=7）,单独使用holo-Lf或apo-Lf组与对照组相比,没有改变SN中TH-ir神经元的数量变化（P>0.05,n=7）。（3）Lf预处理减少MPTP导致的Str中DA、DOPAC、HVA降低与DA代谢率增加。与对照组相比,MPTP处理可显著降低Str中DA、DOPAC和HVA水平,并增加小鼠Str中DA的代谢率。高剂量Lf（15mg/kg holo-Lf和10mg/kgapo-Lf）预处理对MPTP毒性有拮抗作用,恢复DA、DOPAC和HVA的水平,降低DA代谢率至接近正常（P<0.05,n=6）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组与对照组相比,上述指标没有发生显著的变化（P>0.05,n=6）。（4）Lf预处理改善MPTP导致的肢体运动失调。与对照组相比,MPTP处理组小鼠表现出明显的爬杆时间延长,所有剂量的Lf预处理均会抑制MPTP诱导的小鼠爬杆时间延长（P<0.05,n=7）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组与对照组相比,小鼠的爬杆时间没有变化（P>0.05,n=7）。2.Lf对MPTP诱导的PD小鼠神经保护作用的中枢机制研究（1）Lf预处理减少MPTP导致的SN中铁染色阳性细胞数增多。与对照组相比,MPTP处理后会引起SN铁染色阳性细胞数显著增多,所有剂量的Lf预处理都能降低MPTP诱导的铁染色阳性细胞数增多（P<0.05,n=7）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组和对照组之间的铁染色阳性细胞数相比没有变化（P>0.05,n=7）。（2）Lf预处理下调MPTP导致的SN中DMT1表达增加和FPN1表达减少。与对照组相比,MPTP会引起SN中DMT1表达增加和FPN1表达减少,高剂量的Lf预处理（15mg/kg holo-Lf和10mg/kg apo-Lf）会下调由MPTP引起的DMT1表达增加和FPN1表达降低（P<0.05,n=7）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组和对照组相比,DMT1与FPN1的蛋白表达水平都没有变化（P>0.05,n=7）。（3）Lf预处理拮抗MPTP导致的SN中细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax比值和cleaved Caspase-3的表达变化。与对照组相比,MPTP会导致SN中Bcl-2蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值下降,cleaved Caspase-3蛋白的表达增加,高剂量的Lf（15mg/kg holo-Lf和10mg/kg apo-Lf）预处理会逆转这些蛋白表达变化（P<0.05,n=6）。但各组Bax蛋白的表达改变没有统计学意义（P>0.05,n=6）。与对照组相比,单独使用holo-Lf或apo-Lf灌胃处理组上述蛋白的表达没有改变（P>0.05,n=6）。（4）Lf预处理增加MPTP导致的SN中Cu/Zn-SOD蛋白表达减少。与对照组相比,MPTP处理组SN中Cu/Zn-SOD蛋白表达减少,高剂量的Lf（15mg/kgholo-Lf和10mg/kg apo-Lf）预处理能增加MPTP诱导的Cu/Zn-SOD表达的减少（P<0.05,n=7）。单独用holo-Lf或apo-Lf灌胃处理组Cu/Zn-SOD蛋白表达没有改变（P>0.05,n=7）。（5）Lf预处理拮抗MPTP导致的SN中CD86蛋白表达增加。与对照组相比,MPTP能够引起SN中CD86蛋白表达增加,15mg/kg holo-Lf预处理能减少MPTP导致的CD86表达增加（P<0.05,n=8）。单独用15mg/kg holo-Lf灌胃处理与对照组相比CD86蛋白表达不变（P>0.05,n=8）。3.Lf对MPTP诱导的PD小鼠神经保护作用的外周机制研究（1）Lf预处理和/或MPTP处理不影响肝脏的铁染色。普鲁士蓝联合DAB强化铁染色显示,肝脏的各组间铁染色水平无统计学差异（P>0.05,n=6）。（2）Lf预处理拮抗MPTP导致的小鼠脾脏重量的降低。与对照组相比,MPTP处理导致脾脏重量降低,高、中剂量Lf（15mg/kg holo-Lf,10mg/kg holo-Lf和10mg/kg apo-Lf）预处理可以拮抗MPTP导致的脾重量降低（P<0.05,n=6）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组与对照组相比,脾脏的重量没有发生变化（P>0.05,n=6）。（3）Lf预处理减少MPTP导致的小鼠脾脏铁水平的降低。与对照组相比,MPTP导致铁水平在小鼠脾脏组织中显著降低,高、中剂量Lf（15mg/kgholo-Lf,10mg/kg holo-Lf和10mg/kg apo-Lf）预处理可以减少MPTP导致的脾脏铁水平降低（P<0.05,n=6）。单独使用holo-Lf或apo-Lf组与对照组相比,脾脏铁水平没有变化（P>0.05,n=6）。（4）Lf预处理纠正MPTP诱导的外周血中铁代谢紊乱。与对照组相比,MPTP处理会显著升高血清铁、铁蛋白水平并降低血清TIBC,高剂量Lf（15mg/kgholo-Lf和10mg/kg apo-Lf）预处理可以纠正由MPTP导致的外周血清铁和铁蛋白的增加以及血清TIBC的降低（P<0.05,n=5）。与对照组相比,单独给予holo-Lf和apo-Lf组铁水平没有明显差异（P>0.05,n=5）。（5）Lf预处理不影响外周血RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC。血液常规检查发现,红细胞RBC、血红蛋白HGB、红细胞压积HCT、平均红细胞体积MCV、平均红细胞血红蛋白MCH、平均血红蛋白浓度MCHC等溶血和贫血的指标在十个组中均无明显差异（P>0.05,n=5）。上述结果表明:Lf对MPTP诱导的PD模型小鼠有神经保护作用,其机制可能与降低脑铁、抗氧化应激、抗凋亡和抗小胶质细胞介导的炎性反应有关。两种形式的Lf在PD中均具有保护作用。Lf不影响外周铁水平,但能够纠正MPTP诱导的PD模型小鼠的外周铁代谢紊乱。因此Lf是一种安全可靠的既能降低脑铁又不影响外周铁的神经保护剂。