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随着人们生活水平的提高及生活方式的改变,世界范围内糖尿病的发病率逐渐升高,作为糖尿病主要的微血管并发症并发症之一,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)的发生率亦逐渐升高。DN早期肾脏损害的主要表现是微量蛋白尿,提示肾小球滤过屏障受损。肾小球滤过屏障的三层结构中,足细胞层在保持肾小球滤过屏障的完整性和预防蛋白尿方面发挥着重要作用,足细胞损伤可参与DN的发生发展并影响DN患者的预后。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路参与细胞周期、生殖、凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程,活化后可加速诱导肾足细胞的损伤和凋亡,破坏肾小球滤过屏障的完整性。作为全球性的健康问题,DN给患者家庭和社会均带来了严重的经济负担。鉴于化学合成药物的毒副作用,探索一种治疗效果可靠、成本较低、不良反应较少的降低血糖且保护肾脏的药物十分必要。因此,研究者们将目光转向了天然物质。丝胶是蚕丝中包被在丝素外围的高分子水溶性蛋白,本课题组前期根据《本草纲目》的记载,结合我国民间开水浸泡蚕茧后温服用以辅助控制血糖的经验方法,研究发现丝胶(蚕茧水提物)能有效降低血糖,保护糖尿病时肾脏损伤,但丝胶保护糖尿病时肾脏损伤的具体作用机制尚需进一步深入探讨。本研究拟采用高糖致损伤足细胞模型,探讨丝胶是否通过影响JNK信号转导通路对足细胞发挥保护作用,为丰富丝胶保护糖尿病时肾脏损伤的机制研究提供数据支持,以及为临床防治DN提供新思路。目的:通过观察丝胶对高糖致损伤足细胞JNK信号通路相关因子,丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶1(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1,MEKK1)、丝裂原激活蛋白激酶激酶4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4,MKK4)、JNK1、丝裂原活化蛋白(c-Jun NH2-terminal kinases,c-Jun)表达的变化,探讨丝胶是否通过影响JNK信号转导通路对高糖致损伤的足细胞具有保护作用。方法:1足细胞培养、分组、处理:条件永生化小鼠足细胞在33℃、5%二氧化碳培养箱中培养,贴壁增殖;而后转入37℃、5%二氧化碳培养箱培养,取对数生长期足细胞用于后续实验。足细胞分为6组:(1)正常糖组(NG:5.5mmol/L葡萄糖),(2)高糖组(HG:30mmol/L葡萄糖),(3)甘露醇高渗对照组(MG:5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇),(4)丝胶治疗低剂量组(LS:30mmol/L葡萄糖+150μg/L丝胶),(5)丝胶治疗中剂量组(MS:30mmol/L葡萄糖+300μg/L丝胶),(6)丝胶治疗剂高量组(HS:30mmol/L葡萄糖+600μg/L丝胶)。各组足细胞同步化处理12h,不同药物作用48h。2观察足细胞的形态结构:倒置显微镜下分别观察33℃培养、37℃培养时足细胞的形态结构,以及观察各组足细胞的形态结构。3采用Western blot法检测各组足细胞Nephrin、MEKK1、MKK4、JNK1、c-Jun蛋白的表达情况。4采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测各组足细胞Nephrin、MEKK1、MKK4、JNK1、c-Jun m RNA的表达情况。5使用流式细胞仪采用AnnexinⅤ/PI双染法检测各组足细胞的凋亡情况。结果:1足细胞的形态结构1.1不同培养温度下足细胞的形态结构33℃培养时足细胞处于增殖状态,细胞胞体较小,生长速度快,细胞呈现“鹅卵石状”。转入37℃培养足细胞转为分化状态,胞体逐渐增大,并延伸生成足突,相邻足细胞的足突相互连接,呈“树枝状”分布;10-14天左右足细胞完全分化成熟。1.2各组足细胞的形态结构NG组足细胞为37℃培养时的状态;MG组较NG组足细胞无明显变化;HG组足细胞经高糖处理后,细胞体积回缩变小,足突变细、融合,或者消失,相邻细胞之间空隙变大,且随时间延长细胞脱落,悬浮细胞明显增多;较HG组相比,LS、MS、HS组足细胞体积较大,足突较明显,细胞间隙变窄,漂浮、脱落细胞减少,细胞形态趋于正常。2各组足细胞Nephrin的表达与NG组足细胞比较,HG组足细胞Nephrin蛋白及m RNA的表达显著降低(P<0.05);MG组足细胞Nephrin蛋白及m RNA的表达与NG组比较,无明显差异(P>0.05);与HG组比较,LS组、MS组、HS组足细胞Nephrin蛋白及m RNA的表达逐渐增高(P<0.05),且三组足细胞Nephrin蛋白及m RNA的表达两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。3各组足细胞MEKK1的表达与NG组足细胞比较,HG组足细胞MEKK1蛋白及m RNA的表达显著增高(P<0.05);MG组足细胞MEKK1蛋白及m RNA的表达与NG组比较,无明显差异(P>0.05);与HG组比较,LS组、MS组、HS组足细胞MEKK1蛋白及m RNA的表达逐渐降低(P<0.05),且三组足细胞MEKK1蛋白及m RNA的表达两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。4各组足细胞MKK4的表达与NG组足细胞比较,HG组足细胞MKK4蛋白及m RNA的表达显著增高(P<0.05);MG组足细胞MKK4蛋白及m RNA的表达与NG组比较,无明显差异(P>0.05);与HG组比较,LS组、MS组、HS组足细胞MKK4蛋白及m RNA的表达逐渐降低(P<0.05),且三组足细胞MKK4蛋白及m RNA的表达两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。5各组足细胞JNK1的表达与NG组足细胞比较,HG组足细胞JNK1蛋白及m RNA的表达显著增高(P<0.05);MG组足细胞JNK1蛋白及m RNA的表达与NG组比较,无明显差异(P>0.05);与HG组比较,LS组、MS组、HS组足细胞JNK1蛋白及m RNA的表达逐渐降低(P<0.05),且三组足细胞JNK1蛋白及m RNA的表达两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。6各组足细胞c-Jun的表达与NG组足细胞比较,HG组足细胞c-Jun蛋白及m RNA的表达显著增高(P<0.05);MG组足细胞c-Jun蛋白及m RNA的表达与NG组比较,无明显差异(P>0.05);与HG组比较,LS组、MS组、HS组足细胞c-Jun蛋白及m RNA的表达逐渐降低(P<0.05),且三组足细胞c-Jun蛋白及m RNA的表达两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。7各组足细胞的凋亡情况NG组足细胞的早期凋亡率为(6.9±0.62)%;MG组足细胞早期凋亡率为(7.13±0.25)%,与NG组足细胞早期凋亡率比较无明显差异(P>0.05);HG组足细胞的早期凋亡率为(37.53±0.49)%,明显高于NG组(P<0.05);LS组、MS组、HS组足细胞早期凋亡率分别为(28.34±1.02)%、(21.17±0.84)%、(16.27±0.45)%,均明显低于HG组(P<0.05),且三组足细胞早期凋亡率两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:丝胶可通过降低高糖致损伤小鼠足细胞JNK信号通路相关因子MEKK1、MKK4、JNK1、c-Jun的表达,抑制JNK信号通路的激活及减少足细胞凋亡,从而减轻足细胞损伤,对足细胞具有保护作用。