【摘 要】
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目的:类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）,是一种以关节增殖性滑膜炎为主要病理表现的慢性自身免疫性疾病。其病因及发病机制不明,但目前认为Th17细胞过度增殖是类风湿性关节炎的重要发病机制。两面针（Zanthoxylum nitidum,DC）.为芸香科花椒属植物两面针的干燥根,具有活血化瘀,行气止痛,祛风通络,解毒消肿的功能,主治跌打损伤、牙痛、神经痛和风湿麻痹等。氯化
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目的:类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）,是一种以关节增殖性滑膜炎为主要病理表现的慢性自身免疫性疾病。其病因及发病机制不明,但目前认为Th17细胞过度增殖是类风湿性关节炎的重要发病机制。两面针（Zanthoxylum nitidum,DC）.为芸香科花椒属植物两面针的干燥根,具有活血化瘀,行气止痛,祛风通络,解毒消肿的功能,主治跌打损伤、牙痛、神经痛和风湿麻痹等。氯化两面针碱（nitidine chloride,NC）是两面针的主要活性生物碱,近代药理试验证明其具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等方面的作用。本实验考察了氯化两面针碱对CIA小鼠Th17细胞增殖的抑制作用,为氯化两面针碱用于类风湿性关节炎的治疗提供依据。方法:DBA/1小鼠,SPF级,雄性,6-7周龄,体重（20±2）g,以鸡II型胶原与弗氏完全佐剂完全乳化后,在每只实验小鼠的尾根部、背部多点皮内注射0.1ml的混合乳剂,第21天采用相同方法加强免疫1次。选取关节炎指数评分（AI评分）≥4分造模成功者,制备脾淋巴细胞悬液,以鸡II型胶原体外诱导CIA小鼠脾淋巴细胞增殖,考察胶原是否灭活、IL-23等影响因素对Th17细胞体外增殖模型的影响。以cck8法检测不同浓度的氯化两面针碱对正常小鼠脾淋巴细胞的抑制率,选取抑制率适宜的药物浓度进行下步实验。将CIA小鼠脾淋巴细胞分为甲氨蝶呤组和氯化两面针碱高、中、低浓度组,分别加入甲氨蝶呤0.4μg/ml或氯化两面针碱2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml共同培养。体外培养60h后,流式细胞术检测各组细胞CD4+RORγt+Th17细胞比率。结果:1、Th17细胞体外增殖模型的影响因素考察培养前,正常小鼠和CIA小鼠脾淋巴细胞Th17细胞比率（%）分别为0.333±0.153、0.933±0.208。培养60h后,正常对照组、正常+未灭活胶原刺激组、正常+灭活胶原刺激组培养Th17细胞比率（%）分别为0.067±0.056、0.100±0.100、0.067±0.056。CIA对照组、CIA+未灭活胶原刺激组、CIA+灭活胶原刺激组培养60h后Th17细胞比率（%）分别为0.533±0.058、1.830±0.500、1.950±0.265。CIA+未灭活胶原刺激组、CIA+灭活胶原刺激组Th17细胞比率较培养前大幅上升,与CIA对照组相比有统计学上显著性差异（p<0.01）,未灭活胶原刺激组与灭活胶原刺激组两组无统计学差异（p=0.193）。IL-23对Th17细胞体外增殖模型的影响的结果显示,培养60h后,空白对照组、IL-23高剂量组、IL-23中剂量组、IL-23低剂量组、IL-23p19抗体中和组Th17细胞比率（%）分别为1.73±0.58、1.70±0.17、1.67±0.06、1.87±0.15、0.57±0.06。IL-23高、中、低剂量组与空白对照组相比无统计学差异,但IL-23 p19抗体中和组的Th17细胞比率明显下降,与空白对照组相比有统计学上显著性差异（p<0.01）。2、氯化两面针碱对Th17细胞增殖模型抑制作用的流式检测结果显示:培养60h后,模型对照组、MTX对照组、氯化两面针碱高、中、低浓度组Th17细胞比率（%）分别为1.700±0.141、0.367±0.058、0.500±0.082、0.875±0.126、1.325±0.096。氯化两面针碱高、中、低浓度组Th17细胞比率显著下降,与模型对照组相比有统计学差异（p<0.01）。氯化两面针碱中浓度和低浓度组与MTX对照组相比有统计学差异（p<0.01）,高浓度组与MTX对照组相比无统计学差异（p=0.127）。结论:1、未灭活胶原与灭活胶原均不能体外刺激正常小鼠脾Th17细胞增殖,但均可体外刺激CIA小鼠脾Th17细胞的增殖。IL-23是Th17细胞增殖所必须的细胞因子,但向培养液中另外添加不同浓度的IL-23对Th17细胞增殖没有影响。2、氯化两面针碱对Th17细胞增殖均有抑制作用,且随药物浓度增加,抑制Th17细胞增殖的能力也同步增加。氯化两面针碱高浓度组与MTX对照组对Th17增殖的抑制作用相似。
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