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链霉菌复杂的发育和形态分化,暗示其含有丰富的调控系统和调控元件。开发研究链霉菌调控机制的精确方法和新的调控元件,以及将调控元件改造成标准化的元件库,对于改造链霉菌具有重要的指导意义和应用价值。本文主要包含三部分内容,第一部分是改进了细菌双杂交系统:本文在利用该系统时发现存在假阳性高的缺陷。向该系统引入用多拷贝lacZ启动子控制的gfp报告基因,不仅增加了lacZ启动子的数量,弱化了生理因素的影响,还实现了gfp与lacZ两个报告基因同时报告蛋白间互作的情况,提高了输出的准确性。进一步用此系统研究天蓝色链霉菌(Streptomyces.coelicolor M145)的BldM和WhiI蛋白,结果表明其灵敏性得到了大幅提高。本研究改进的方法能很精确的解析蛋白间的互作,对于研究链霉菌的分子调控和次级代谢产物生物合成等生物学过程具有重要指导意义。第二部分是构建了链霉菌组成型启动子库:通过分析不同培养条件下S.coelicolor M145的5个转录组芯片,筛选了 941个稳定表达的基因,进一步采用"内部干扰分析—外部干扰分析—基因功能分析—基因组定位—转录丰度分析"流程,得到166个组成型启动子。随机挑选8个不同转录丰度的启动子,分别在S.coelicolor M145,委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezueloe WVR2006)和白色链霉菌(Streptomyces albus J1074)中,用GFP报告系统和实时荧光定量PCR对其进行了表征,结果表明此8个启动子能够使下游基因在不同条件下稳定表达。随机挑取其中的4个启动子激活S.venezuelAe ISP5230隐性基因簇杰多霉素B的表达,进一步验证了启动子的组成型。本工作丰富了链霉菌的启动子元件库,有助于链霉菌在代谢工程和合成生物学方面的研究。第三部分是开发了筛选生理启动子的新方法:首先以S.coelicolor M145为宿主菌,用异丙基苯甲酸cumate诱导表达系统适时适量表达ActⅡ-orf4调控蛋白,控制放线紫红素Act的产量,通过单因素试验,正交试验和响应面分析,确定了最佳诱导时间和诱导剂量。在最佳诱导条件下进行了 RT-PCR和RNA-seq试验,结合S.cowlicolor M145基因芯片数据,得到诱导启动子和生理启动子的转录时序。筛选与诱导启动子转录时序一致的生理启动子,并进行试验验证。本研究建立的方法为生理启动子代替诱导启动子提供了方法依据,具有良好的应用前景。