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自20世纪以来,全球范围内2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患病率激增,糖尿病的各种并发症致残、致死率很高,昂贵的医疗费用支出给社会和家庭带来了巨大负担。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病理生理学基础,能量摄入和消耗之间的不平衡会导致靶器官的胰岛素抵抗,能量代谢障碍与2型糖尿病复杂的发病机制密切相关。白藜芦醇（Resveratrol,Rsv）是一种天然多酚化合物,具有二苯乙烯结构,在动物实验和临床研究中证实白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、抗血小板和抗凝等广泛作用。数十年来的研究显示,白藜芦醇在预防和治疗慢性代谢性疾病中发挥有益的作用,其在2型糖尿病中的作用也得到证实,白藜芦醇能够在一定程度上调节糖代谢异常,改善胰岛素抵抗,但具体作用机制尚不清楚,有待深入研究。腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate-activated protein kinase,AMPK）是一种调节能量稳态以及葡萄糖和脂质代谢的生物分子。研究表明AMPK通过各种直接和间接因素活化后有助于改善胰岛素抵抗,对维持血糖稳态起重要作用,被认为是治疗2型糖尿病及其并发症新的靶点。多项研究表明白藜芦醇可通过AMPK途径改善小鼠的胰岛素抵抗,同时可影响胰岛素分泌和降低血糖,但白藜芦醇对AMPK调节的机制仍不清楚。Ca2+/Ca M依赖性蛋白激酶激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,Ca MKKβ)是AMPK的上游激酶,蛋白磷酸酯酶2A（Protein phosphatase2A,PP2A）是丝氨酸苏氨酸磷酸酶,可使活化的AMPK去磷酸化;PP2A和Ca MKKβ在调节肝细胞糖代谢中起重要作用。因此,我们推测白藜芦醇可能通过调节肝脏中Ca MKKβ、PP2A表达而影响AMPK活性改善胰岛素抵抗。本研究首先选择不同糖代谢人群为研究对象,了解血清钙、钙调蛋白与胰岛素抵抗的相关性;建立高脂诱导胰岛素抵抗小鼠模型,并予白藜芦醇干预,应用分子生物学方法观察白藜芦醇对高脂胰岛素抵抗小鼠肝脏Ca MKKβ、PP2A、AMPK表达的影响;最后通过棕榈酸干预肝脏Hep G2细胞,在细胞水平上验证白藜芦醇通过Ca MKKβ/AMPK通路改善胰岛素抵抗及糖代谢,揭示白藜芦醇减轻胰岛素抵抗的作用及可能机制,为寻找2型尿病的预防和治疗的新靶点提供理论依据。第一部分不同糖代谢人群血清钙、钙调蛋白水平与胰岛素抵抗的相关性研究目的:通过测定不同糖代谢人群血清钙、钙调蛋白的水平,探讨血清钙及钙调蛋白与胰岛素抵抗的关系。方法:选取2018年1月至2018年8月在河北省人民医院内分泌科招募志愿者,受试者填写知情同意书,经过问卷调查后常规体检,行75g口服葡萄糖耐量试验,依据2017版《中国2型糖尿病防治指南》诊断标准,将受试者分为三组,糖耐量正常组（Normal glucose tolerance,NGT）47人、糖调节受损组（Impaired glucose regulation,IGR）49人、糖尿病组（Diabetes mellitus,DM）44人。检测患者血清钙、空腹血糖、空腹胰岛素、血脂、糖化血红蛋白（Hb A1c）水平等,Elisa法测定血清钙调蛋白;计算胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR）;探讨血清钙、钙调蛋白与胰岛素抵抗的相关性。结果:1.三组人群一般指标的比较糖耐量正常组、糖调节受损组、糖尿病组的三组人群年龄、BMI差异没有统计学意义（P＞0.05）。与糖耐量正常组相比,糖调节受损组、糖尿病组的空腹血糖、餐后2小时血糖、空腹胰岛素、总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、Hb A1c升高,HDL-C水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.三组人群血清钙水平比较糖尿病组、糖调节受损组血清钙水平高于糖耐量正常组,糖尿病组高于糖调节受损组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.三组人群血清钙调蛋白水平比较糖尿病组、糖调节受损组血清钙调蛋白水平高于糖耐量正常组,糖尿病组高于糖调节受损组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.三组人群胰岛素抵抗指数的比较与糖耐量正常组相比,糖尿病组、糖调节受损组胰岛素抵抗指数升高（P＜0.05）。糖尿病组胰岛素抵抗指数高于糖调节受损组,差异有统计学意义（P＜0.05）5.血清钙水平变化与HOMA-IR、Hb A1C的相关性分析血清钙水平与HOMA-IR成正相关（P＜0.05）,与Hb A1C呈正相关,差异有统计学意义（P＜0.05）。6.血清钙调蛋白水平与HOMA-IR、Hb A1C的相关性分析血清钙调蛋白水平与HOMA-IR成正相关,与Hb A1C呈正相关,差异有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.血清钙、钙调蛋白水平升高与糖耐量受损和糖尿病的发生密切相关;2.血清钙、钙调蛋白水平与胰岛素抵抗指数成正相关。第二部分白藜芦醇对胰岛素抵抗小鼠肝脏Ca MKKβ、PP2A、AMPK表达的影响目的:探讨白藜芦醇对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏Ca MKKβ、PP2A、AMPK表达的影响。方法:6-8周龄清洁级健康的C57BL/6J小鼠50只,喂养1周后,随机分为2组:正常对照组（Control）10只给予普通饲料喂养,高脂组（high fat diet,HFD）40只给予高脂饲料喂养。喂养4周末,对照组和高脂组随机抽取6只小鼠,待测小鼠禁食12小时过夜,次晨空腹行腹腔注射糖耐量实验,并计算葡萄糖曲线下面积（area under the curve,AUC）。胰岛素抵抗模型造模成功后,将高脂喂养组40只随机分为高脂组（HFD组）,白藜芦醇低剂量组（RE-L组）,白藜芦醇中剂量组（RE-M组）,白藜芦醇高剂量组（RE-H组）,每组10只。白藜芦醇高中低剂量各组给予不同浓度的白藜芦醇100mg/kg/d、80mg/kg/d、60 mg/kg/d灌胃,正常对照组和高脂组根据体重给予含0.1%二甲基亚砜（DMSO）的0.9%氯化钠溶液灌胃。白藜芦醇干预8周末行OGTT试验,记录血糖变化值并评估小鼠糖代谢状态。白藜芦醇干预12周末,采集血清标本检测空腹血糖（fasting plasmaglucose,FPG）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein,LDL-C）、高密度脂蛋白（High-density lipoprotein,HDL-C）、空腹胰岛素（Fasting insulin FINS）。计算HOMA-IR和QUICKI值评估胰岛素抵抗情况。H＆E染色观察肝脏组织形态学的变化。采用RT-PCR检测肝脏组织AMPK（Adenosine 5’-monophosphate activated protein kinase,AMPK）以及Ca MKKβ（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,Ca MKKβ）、PP2A（Protein phosphatase 2A,PP2A）的m RNA水平。蛋白质印迹法（Western blot）检测肝脏组织AMPK、p-AMPK、Ca MKKβ、p-Ca MKKβ、PP2A蛋白表达情况。结果:1.胰岛素抵抗模型的构建高脂饮食喂养4周末行IPGTT试验,高脂组较正常对照组小鼠0 min、15 min、30 min、60 min、120 min血糖水平均升高（P＜0.05）,与正常对照组相比,高脂组葡萄糖曲线下面积AUC显著增加（P＜0.05）。证明高脂饮食诱导胰岛素抵抗模型成功建立。2.白藜芦醇干预8周末OGTT结果及胰岛素抵抗参数的比较与正常对照组相比,高脂组小鼠在OGTT实验0 min、30 min、60 min、90 min、120 min血糖水平明显升高（P＜0.05）,白藜芦醇各组与高脂组相比在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min血糖水平下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比,高脂组小鼠葡萄糖曲线下面积AUC、空腹胰岛素、HOMA-IR明显升高,白藜芦醇各组与高脂组相比,葡萄糖曲线下面积AUC、空腹胰岛素、HOMA-IR显著下降（P＜0.05）。3.白藜芦醇干预12周末各指标变化情况1)各组小鼠体重比较:高脂组小鼠体重较正常对照组显著增加P＜0.05),白藜芦醇各剂量组较高脂组体重明显下降（P＜0.05）,白藜芦醇高剂量组体重降低更明显。2)各组小鼠空腹胰岛素、血糖、胰岛素抵抗指数的比较:与正常对照组相比,高脂组空腹血糖明显升高,白藜芦醇各组空腹血糖较高脂组明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组相比,高脂组胰岛素水平、HOMA-IR明显升高,QUICKI值明显减低。白藜芦醇各组胰岛素水平、HOMA-IR较高脂组明显降低,QUICKI值显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。白藜芦醇能够显著改善胰岛素抵抗模型组的血糖及胰岛素敏感性,呈现剂量依赖性。3)各组小鼠血脂水平比较:与正常对照组相比,高脂组小鼠血清TC、TG、LDL-C均显著升高（P＜0.05）,血清HDL-C下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。与高脂组相比,白藜芦醇各组小鼠血清TC、TG、LDL-C均显著降低（P＜0.05）,血清HDL-C升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。白藜芦醇各剂量组上述指标改善程度不同,白藜芦醇高剂量组血脂改善程度更明显。4.各组小鼠肝脏组织形态学变化情况H＆E染色可见正常对照组肝细胞结构清晰,胞浆均匀红染,脂滴空泡较少。高脂组肝细胞结构模糊、紊乱,胞浆内可见大小不等的脂滴空泡。白藜芦醇各剂量组干预后肝组织结构有所好转,脂肪变性减轻,脂滴空泡较高脂组减少。5.各组小鼠肝脏组织Ca MKKβ、PP2A、AMPK的m RNA基因水平比较与正常对照组相比,高脂组小鼠肝脏PP2A的m RNA表达水平升高（P＜0.05）,白藜芦醇各组PP2A的m RNA表达水平下降（P＜0.05）。各组间Ca MKKβ、AMPK的m RNA水平无明显差异。6.各组小鼠肝脏AMPK、Ca MKKβ、PP2A蛋白表达的比较与正常对照组相比,高脂组小鼠肝脏p-Ca MKKβ/Ca MKKβ、p-AMPK/AMPK比值明显降低,PP2A蛋白表达水平升高（P＜0.05）。与高脂组相比,白藜芦醇各组肝脏p-Ca MKKβ/Ca MKKβ、p-AMPK/AMPK比值明显升高,PP2A蛋白表达水平下降（P＜0.05）。小结:1.白藜芦醇改善高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗;2.白藜芦醇能够通过Ca MKKβ/AMPK通路改善肝脏糖代谢,改善肝脏胰岛素抵抗。第三部分白藜芦醇通过调节Ca MKKβ、PP2A、AMPK表达改善Hep G2细胞糖代谢的研究目的:体外建立Hep G2细胞胰岛素抵抗模型,验证白藜芦醇通过Ca MKKβ、PP2A而影响AMPK表达,改善Hep G2细胞糖代谢的机制方法:培养Hep G2细胞,用0.25 mmol/L棕榈酸（PA）孵育Hep G2细胞建立胰岛素抵抗模型并鉴定。造模成功后将细胞分为对照组、棕榈酸孵育组、棕榈酸+5μM白藜芦醇组、棕榈酸+12.5μM白藜芦醇组、棕榈酸+25μM白藜芦醇、棕榈酸+40μM白藜芦醇组、棕榈酸+50μM白藜芦醇。采用2-NBDG方法测定葡萄糖摄取率,糖原（glycogen）测定试剂盒检测肝细胞的糖原,探讨白藜芦醇对胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖代谢的影响。在棕榈酸联合白藜芦醇培养的Hep G2细胞中分别给予27μmol/L STO-609（Ca MKKβ抑制剂）,30μmol/L DT-061（PP2A激活剂）及20μmol/L Compound C（AMPK抑制剂）干预,并设立正常对照组,测定葡萄糖摄取率及细胞的糖原合成,采用western blot检测AMPK,p-AMPK,Ca MKKβ、p-Ca MKKβ、PP2A的蛋白表达情况。结果:1.Hep G2细胞胰岛素抵抗模型的建立于PA干预的0 h、12 h、24 h分别测培养基中的葡萄糖浓度,在0 h和12 h Control组和PA组之间培养基中葡萄糖浓度没有显著差异。于24 h处PA组较Control组培养基中的葡萄糖浓度显著增加（P＜0.05）,提示PA诱导胰岛素抵抗细胞模型建立成功。2.油红O染色PA模型组可见橘红色脂滴增多,对照组细胞淡蓝色的胞浆,橘红色脂滴较少。表明PA模型组有脂质沉积,胰岛素抵抗模型建立成功。3.细胞存活率白藜芦醇浓度为100μM、50μM、25μM、12.5μM、5μM时,干预24 h后细胞存活率分别为45.63%、79.73%、82.06%、86.36%、90.40%。PA组的细胞存活率为79.36%。因此本实验选择5-50μM作为进一步研究白藜芦醇作用的条件。4.不同浓度白藜芦醇对Hep G2细胞的2NDBG摄取率的影响与对照组相比,棕榈酸+5μM白藜芦醇组、棕榈酸+12.5μM白藜芦醇组、棕榈酸+25μM白藜芦醇组、棕榈酸+40μM白藜芦醇组、棕榈酸+50μM白藜芦醇组的Hep G2细胞2NDBG摄取率逐渐升高。与对照组相比,PA模型组2NDBG摄取率明显降低（P＜0.05）与PA模型组相比,白藜芦醇干预后2NDBG摄取率明显升高（P＜0.05）,说明白藜芦醇组显著增加胰岛素抵抗Hep G2细胞的葡萄糖摄取量,且增加细胞葡萄糖摄取量的效果呈剂量依赖性。5.不同浓度白藜芦醇对Hep G2细胞糖原含量的影响。与对照组相比,棕榈酸+12.5μM白藜芦醇组、棕榈酸+25μM白藜芦醇组、棕榈酸+40μM白藜芦醇组、棕榈酸+50μM白藜芦醇组、的Hep G2细胞糖原合成逐渐升高。与对照组相比,PA模型组糖原合成明显降低（P＜0.05）,白藜芦醇干预后较PA模型组糖原合成明显升高（P＜0.05）,说明白藜芦醇组显著增加胰岛素抵抗Hep G2细胞的糖原合成。6.应用PP2A激动剂、Ca MKKβ抑制剂、AMPK抑制剂对Hep G2细胞2NDBG摄取率的影响与正常对照组相比,PA模型组2NDBG摄取率明显降低（P＜0.05）,而PA+白藜芦醇组2NDBG摄取率较PA模型组明显升高（P＜0.05）,较RE+PP2A激动剂DT-061组、RE+Ca MKKβ抑制剂STO-609组显著降低了白藜芦醇对葡萄糖摄取率的改善（P＜0.05）,但两者仍然显著明显高于PA模型组（P＜0.05）。当应用RE+AMPK抑制剂Compound C后,与PA模型组相比,白藜芦醇对葡萄糖摄取的影响被抵消,两者均无显著差异。7.应用PP2A激动剂、Ca MKKβ抑制剂、AMPK抑制剂对Hep G2细胞的糖原含量的影响与正常对照组相比,模型组糖原合成明显降低（P＜0.05）,而PA+白藜芦醇组糖原合成较PA模型组明显升高（P＜0.05）,较RE+PP2A激动剂DT-061组、RE+Ca MKKβ抑制剂STO-609组显著降低了白藜芦醇对糖原合成的改善（P＜0.05）,但两者仍然显着明显高于PA模型组（P＜0.05）。当应用RE+AMPK抑制剂Compound C后,与PA模型组相比,白藜芦醇对糖原合成的影响明显减少。8.应用Ca MKKβ抑制剂STO-609对AMPK、Ca MKKβ蛋白表达水平的影响Western blot结果显示,与对照组相比,PA模型组的p CAMKKβ/CAMKKβ、p-AMPK/AMPK明显降低（P＜0.01）;而白藜芦醇组p CAMKKβ/CAMKKβ、p-AMPK/AMPK较PA模型组明显升高（P＜0.01）。应用Ca MKKβ抑制剂STO-609后,STO-609组p CAMKKβ/CAMKKβ、p AMPK/AMPK的表达较白藜芦醇对照组均显著下降（P＜0.05）,说明Ca MKKβ的抑制剂STO-609明显抑制了AMPK磷酸化的表达。与STO-609组相比,白藜芦醇+STO-609组p AMPK/AMPK明显升高（P＜0.05）,较白藜芦醇RE对照组相比仍降低（P＜0.05）。9.应用PP2A激动剂DT-061对AMPK、PP2A蛋白表达水平的影响Western blot结果显示:与对照组相比,PA模型组的p-AMPK/AMPK表达明显降低（P＜0.01）,PP2A表达明显升高（P＜0.01）;而PA+白藜芦醇组p-AMPK/AMPK明显升高（P＜0.01）,PP2A表达水平明显降低（P＜0.01）。应用PP2A激动剂DT-061后,PA+DT-061组p-AMPK/AMPK明显降低（P＜0.05）,PP2A表达明显升高（P＜0.05）。与DT-061组相比,白藜芦醇+DT-061组p AMPK/AMPK明显升高（P＜0.05）,较白藜芦醇RE对照组相比仍降低（P＜0.05）。10.应用AMPK抑制剂Compound C对AMPK蛋白表达水平的影响Western blot结果显示:与对照组相比,PA模型组的p-AMPK/AMPK水平明显降低（P＜0.01）,而PA+白藜芦醇组p-AMPK/AMPK较PA模型组明显升高（P＜0.05）,较PA+Compound C组明显降低（P＜0.05）,较PA+RE+Compound C组显著下降（P＜0.05）,说明Compound C明显抑制了AMPK磷酸化的表达。小结:1.不同浓度的白藜芦醇对Hep G2细胞的作用不同,白藜芦醇通过增加Hep G2-IR细胞的葡萄糖摄取、促进糖原合成,改善了Hep G2细胞的胰岛素抵抗。2.白藜芦醇能改善PA诱导的Hep G2细胞的胰岛素抵抗,在细胞水平上证实白藜芦醇调控Ca MKKβ/AMPK通路改善PA诱导的胰岛素抵抗及肝脏糖代谢。结论:1.血清钙及钙调蛋白的升高与糖调节受损和糖尿病的发生密切相关;2.白藜芦醇可调节胰岛素抵抗小鼠肝脏AMPK的活性,改善肝脏糖代谢和胰岛素抵抗;3.白藜芦醇调节肝脏AMPK的活性的重要机制之一是通过调控Ca MKKβ、PP2A实现的。