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现今,土壤重金属污染已经成为一种严重的土壤污染问题。土壤中含有过量的重金属镉,会对植物正常生长产生影响。桑树对恶劣的土壤和环境条件具有较高的耐受性,已证明使用桑树改善环境能够减少环境治理的成本。本论文分析了桑树在重金属镉的胁迫下的生理生化指标、转录组、miRNA差异,并对响应镉胁迫的基因进行了克隆及功能鉴定。研究结果有助于进一步阐述植物高效耐镉的分子机理以及为培育高耐镉新品种提供一定的理论依据。主要研究内容如下:1.镉胁迫下桑树的生理生化指标及转录组分析检测镉胁迫下桑树幼叶和根系中几种不同的生理生化指标,桑树体内植物可溶性蛋白含量(BCA)、超氧化歧化酶活性(SOD)、过氧化物酶活性(POD)、脯氨酸含量(Pro)以及丙二醛(MDA)的含量在镉胁迫下均产生差异变化,证明镉胁迫影响桑树正常的生理生长。通过转录组测序分析,比较了正常生长状态下和镉胁迫下的桑树幼叶以及根系中差异表达基因,桑叶中发现1291个差异表达基因,其中712个上调,579个下调;桑树根系共发现差异表达基因3411个,其中2735个上调,676个下调。根据上述结果报告,分别对桑树幼叶和桑树根中的表达差异基因进行GO注释和KEGG富集等生物信息学分析,并分别检测了桑叶和桑树根中部分基因的表达水平,验证结果与转录组结果相符。经过转录组分析后,发现与核糖体相关的基因应答程度最大。另外发现表达水平上调的钙依赖型蛋白激酶(CDPK26)基因和环核苷酸门控离子通道(CNGC14)基因参与镉胁迫下桑树信号转导。2.桑树miRNA测序结果分析通过miRNA测序分析,在桑叶中发现18个表达水平差异的miRNA,其中5个miRNA表达水平上调,13个miRNA表达水平下调;桑树根系共发现差异表达miRNA27个,其中16个表达水平上调,11个表达水平下调。对差异miRNA相关靶基因进行了功能注释和富集等生物信息学分析,验证分析了桑叶和桑树根中部分差异miRNA的表达水平。桑树应答镉胁迫过程中miRNA表达差异较大的靶基因主要富集于代谢过程。3.桑树钙依赖型蛋白激酶(MaCDPK26)基因的克隆、表达分析及功能鉴定从桑树中克隆获得MaCDPK26基因,该基因完整的ORF长度为1826 bp,编码含有607个氨基酸的蛋白质,其分子质量为68.107 Kd,等电点为5.41;登录号为(Gen Bank NO:MT431589)。对其进行三级结构预测分析,推测MaCDPK26基因的功能。分析其与其他物种的同源性以及亲缘性。经过定量分析表明在镉胁迫下MaCDPK26基因的表达量增加。桑树MaCDPK26基因成功在大肠杆菌中表达。利用VIGS体系,沉默桑树中MaCDPK26基因。比较实验组与对照组中桑树样品MaCDPK26基因表达水平,结果显示成功沉默基因,转基因植株中桑树MaCDPK26基因表达量水平显著降低。生理生化检测结果表明实验组与对照组桑树样品生理生化指标有较大的差异,而两组对照组数据基本持平。通过MaCDPK26基因表达量差异以及生理指标的差异,推测桑树MaCDPK26基因表达可以提高桑树的耐镉能力。4.桑树环核苷酸门控离子通道(MaCNGC14)基因的克隆、表达分析及功能鉴定从桑树中克隆获得MaCNGC14基因,该基因完整的ORF长度为2235 bp,编码含有744个氨基酸的蛋白质,其分子质量为85.422 Kd,等电点为8.99;登录号为(Gen Bank NO:MT431588)。经过同源比对发现MaCNGC14基因在不同的物种间差异较小,保守性较高。定量分析表明在镉胁迫下MaCNGC14基因表达量增加。利用VIGS体系,沉默桑树中MaCNGC14基因。比较实验组与对照组中桑树MaCNGC14基因表达水平,结果显示成功沉默基因,转基因植株中桑树MaCNGC14基因表达量水平明显下降。生理生化检测结果表明实验组与对照组桑树样品生理生化指标有较大的差异,且两组对照组数据基本持平。通过MaCNGC14表达量差异以及生理指标的差异,推测桑树MaCNGC14基因的表达可以提高桑树的耐镉能力。