猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒,包括两个基因型:I型(欧洲型)和II型(北美型)。PRRSV包含至少9个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1编码的非结构蛋白负责病毒基因组复制和mRNA合成的病毒复制转录复合体;ORF2-ORF7编码病毒的结构蛋白,其中,ORF7编码的核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N蛋白)是一个分子量约为15kD的碱性多功能蛋白。同源性较低的I型和II型PRRSV代表株的N蛋白长度分别为128和123个氨基酸,而且I型N蛋白长度呈现多态性。mRNA7起始密码子前包含一段长达319碱基的前导序列(其中含有两个AUG,但并不起始翻译),所以ORF7的翻译调控机制还不清楚。另外,N蛋白已被证明在病毒粒子的装配中起着重要作用,但是关于N蛋白能够发挥作用的最小功能域还是未知的。在PRRSV感染性克隆平台的基础上,本研究第一部分是关于N蛋白翻译起始位点的研究,以将ORF6和ORF7之间的重复序列拉开并插入酶切位点的感染性克隆pORF673为模板,分别构建了3个ATG的系列突变体,通过病毒拯救表明N蛋白的翻译优先使用前导序列之后的第一个AUG;在迫使病毒使用导致ORF7移码的人工插入AUG时,PRRSV可以通过碱基插入矫正读码框,使得N蛋白的前11个氨基酸可以完全改变但不影响病毒感染性;N蛋白的N端可以插入至少12个氨基酸也不影响病毒感染性。第二部分是关于N蛋白末端及中间序列在病毒复制过程中作用的研究。本文首先选取N蛋白的N端和C端进行系列缺失,通过转染MARC-145细胞及病毒拯救,表明N端的5-13位氨基酸和C端的最后4个氨基酸对于病毒感染性是非必需的,意外的是,这些拯救病毒除了保持所操作缺失的稳定存在外,N基因中都出现了额外突变,包括氨基酸的替换、缺失及插入等,重复转染试验证明了额外突变存在的必然性。对于没有感染性的突变体通过免疫荧光及RT-PCR来检测基因组复制及sgmRNA转录特性,表明14-20位之间的保守区域可能包含着病毒复制所必需的元件。为了研究这些额外突变(替换、缺失、插入)本身对病毒的影响,我们又重新构建了单独包含额外突变的两个突变体pN?39-42和pN?48-52,及同时包含原来所做缺失和额外突变的两个突变体pC?3/Y61C和pC?3/N?48-52。这些突变体转染细胞后都能拯救出病毒,同时拯救病毒vN?48-52和vC?3/N?48-52的N基因中仍有额外突变出现,包括点突变及氨基酸的插入。表明N蛋白的中间区域本身也可以承受氨基酸的缺失。综上所述,本研究证明PRRSV的N蛋白具有以下特性:(1)其翻译倾向于使用前导序列之后的第一个AUG;(2)N端第1-11位氨基酸序列特异性对病毒复制是非必需的;(3) N端第5-13位氨基酸可以缺失而不影响病毒感染性;(4)N端第14-20位氨基酸序列缺失或所致核苷酸及蛋白结构变化导致PRRSV感染性、基因组复制和mRNA转录的功能丧失;(5)C端最后4个氨基酸的缺失不影响病毒的感染性,进一步缺失虽不影响RNA合成及翻译,但病毒装配或出芽过程受损而导致了病毒感染性的丧失;(6)N蛋白的中间区域(aa39-52)也可以承受氨基酸的缺失。所有的拯救病毒在N基因中都出现了额外突变。这些研究成果对进一步剖析PRRSV N蛋白结构与功能的关系,及研发基因标识疫苗奠定了基础。