随着医疗技术的飞速发展,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后患者治愈率得到极大的提高。但由于缺乏有效预测指标和治疗措施,急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD),特别是激素耐药的aGVHD,仍是制约allo-HSCT治愈率的关键技术性瓶颈[1]。aGVHD对靶细胞的损害可分为三步:(1)治疗相关的损伤导致炎性细胞因子的大量释放,从而启动aGVHD;(2)T细胞激活后开始增殖活化;(3)T细胞攻击患者上皮组织或器官。故aGVHD治疗的关键在于抑制T细胞的增殖活化,但这也带来了肿瘤复发和重症感染的风险[2,3]。自然杀伤(Natural killer,NK)细胞可快速杀伤患者体内变异的细胞,具有抗肿瘤和抗感染的作用,对allo-HSCT具有重要意义。进一步研究发现,NK细胞在抗肿瘤、抗感染的同时,还具有抗aGVHD和促进移植物植入的作用[4],为防治aGVHD带来了新的希望。NK细胞在allo-HSCT后快速实现数量重建[5,6],此时NK细胞抗aGVHD作用是靠杀伤抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APCs),阻断T细胞的活化而得以实现[7]。NK细胞同时表达抑制性和活化性受体,其对APCs的杀伤活性是由两种受体与配体的结合情况共同决定的。当APCs表面抑制性配体表达缺失,或活化性配体表达高于抑制性配体时,NK细胞将被激活,特异性的杀伤APCs。近年来的研究发现,allo-HSCT后免疫重建的NK细胞表面的受体谱表达改变,特别是抑制性受体表达上调,导致免疫重建的NK细胞功能受到抑制,杀伤靶细胞的活性低下。NK细胞功能抑制这一情况将持续到allo-HSCT后半年左右[8,9]。免疫重建的NK细胞作为一种功能被抑制的免疫细胞,是否还能杀伤APCs,是否还能有效发挥抗aGVHD作用,目前尚未明确。本研究通过分析NK细胞的重建情况,探讨NK细胞重建与aGVHD的相关性,为进一步研究重建NK细胞的抗aGVHD作用奠定了基础。本研究首先观察了患者allo-HSCT后NK细胞计数和活性与正常人的差异,分析了allo-HSCT后NK细胞计数和活性恢复情况,从而综合评价NK细胞的重建。实验思路简述如下:选取2015年1月至2015年7月,在本院行allo-HSCT的26例患者,其中男性17例,女性9例,患者中位年龄37(12~62)岁。采集患者allo-HSCT后+30d、+60d、+90d时外周血作为实验组,通过流式细胞仪(flowcytometry,FCM)检测外周血中NK细胞计数和活性。将供者作为对照组,界定NK细胞计数和活性的正常值。将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分离出外周血后计数。用CD45-APC、CD56-FITC、CD16-FITC和CD3-PerCP标记PBMCs,FCM检测出PBMNs中CD45、CD3、CD56、CD16的表达情况,计算CD3-CD56+CD16+的NK细胞计数。用CSFE荧光标记K562细胞。将K562细胞单独孵育作为对照组,观察K562细胞自然凋亡率。将NK细胞与K562细胞按1:1比例共同培养作为实验组,观察NK细胞对K562细胞杀伤活性。对照组和实验组细胞在培养箱中孵育2.5小时后用碘化丙啶(propidium Iodide,PI)标记,FCM检测CSFE+PI+的细胞(即凋亡的K562),最后计算出NK细胞杀伤活性。根据不同时间点NK细胞计数和活性的检测结果,探索allo-HSCT后NK细胞数量和功能的重建情况。研究结果显示:正常人NK细胞计数和活性为(1198±514)个/μl和(14.0±6.8)%。患者allo-HSCT后+30d、+60d、+90d时NK细胞计数分别为(951±403)个/μl、(1358±418)个/μl和(1255±353)个/μl,与正常人无统计学差异。患者NK细胞活性分别为(7.3±3.7)%、(9.4±3.6)%和(9.3±2.4)%,较正常人显著降低。以上结果说明,allo-HSCT后+30d时,NK细胞计数能恢复到正常人水平。但allo-HSCT后+90d内,NK细胞活性低下。NK细胞计数和活性在allo-HSCT后+30d时较+60d、+90d时低下。Allo-HSCT后NK细胞计数和活性的降低是否会影响其抗aGVHD作用,从而增加aGVHD发病的风险则有待于进一步研究。因此,本研究第二部分对26例患者进行了跟踪随访,以探索NK细胞重建对aGVHD发病的影响。实验思路简述如下:根据患者的临床表现和相关病理指标,统计26例患者aGVHD发病、总体生存(overall survival,OS)和无进展生存(progression-free survival,PFS)等临床资料,分析NK细胞计数和活性与aGVHD发病和预后的相关性。研究结果显示:根据患者是否发生aGVHD,将26例患者分为aGVHD组(11例)和无aGVHD组(15例)。与无aGVHD组相比,aGVHD组患者在allo-HSCT后+30d时NK细胞计数和活性显著降低,即(655±216)个/μlvs(1169±372)个/μl(p=0.002)和(7.3±3.6)%vs(9.0±3.6)%(p=0.008)。根据患者是否发生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD,进一步将26例患者分为Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组(7例)和0~Ⅰ度aGVHD组(19例)。与0~Ⅰ度aGVHD组相比,Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组患者NK细胞计数和活性同样显著降低,且差异更为显著,即(617±220)个/μl vs(1081±399)个/μl(p=0.001)和(4.2±1.7)%vs(8.3±3.5)%(p=0.001)。NK细胞计数(γ=—0.628,p=0.001)及活性(γ=—0.535,p=0.005)与aGVHD发病呈中度负相关。生存结果显示,Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组复发率显著升高(57%vs 5%,p=0.010),且1年PFS率明显下降(43%vs 84%,p=0.010)。Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组患者的1年OS率同样低于0~Ⅰ度aGVHD组(71%vs 90%),但无统计学差异(p=0.374)。以上结果说明,allo-HSCT后发生aGVHD的患者+30d时NK细胞计数和活性较未发生aGVHD的患者显著降低,且发生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD患者的NK细胞计数和活性降低更为显著。Allo-HSCT后+30d时NK细胞计数和活性与aGVHD呈中度负相关性。+30d时NK细胞计数和活性低下的aGVHD患者,其复发率显著高,PFS率显著降低。综上,本研究结果显示,allo-HSCT后+30d时,NK细胞完成数量重建,但+90d内NK细胞活性显著低于正常人水平。Allo-HSCT后+30d时,重建NK细胞的计数和活性处于最低水平,且与aGVHD的发生和预后存在一定联系,通过早期监测NK细胞计数和活性可识别aGVHD高危患者,这将为防治aGVHD提供新的思路。