研究背景及目的原发性肝癌(primary liver cancer, PLC)是世界上常见的恶性肿瘤之一,90%以上为肝细胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC),在男性中,其发病率占恶性肿瘤发病率的第二位,在女性中,其发病率占恶性肿瘤发病率的第六位；据最新统计,全球每年新发病例达到782500,因肝癌死亡的患者人数达到745500,病死率达到95%。我国肝癌发病人数占世界发病人数的50%,因此肝癌已成为威胁我国人民健康和生命的一大杀手。快速增殖是肝癌重要的生物学特点之一,肝癌的快速增殖是导致许多肝癌患者预后较差,5年生存率低的重要因素之一。因此,研究导致肝癌快速增殖的原因,揭示肝癌快速增殖的分子机制对提高肝癌患者预后有着极其重要的作用。长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是广泛存在于真核生物中的一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的RNA分子,可以在多种层面上(表观遗传调控、转录调控及转录后调控等)调控基因的表达水平。按其与mRNA之间的位置关系大致分为五种类型：(1)正义长链非编码RNA；(2)反义长链非编码RNA；(3)双向长链非编码RNA；(4)内含子型长链非编码RNA；(5)基因间长链非编码RNA(即large intergenic noncoding RNA, lincRNA)。在整个基因组转录产物中,lncRNA所占的比例远远超过mRNA的比例。对于lncRNA的鉴定使我们对整个功能性基因调控方式进行了重新解读,通过研究lncRNA的生物学功能及其在疾病中的调控机制,能够更全面的理解疾病的发生机理,寻找新的疾病诊断标志物以及治疗靶点。本研究首先应用lncRNA芯片技术筛选出在肝癌与对应癌旁组织中差异表达的lncRNA,然后利用qRT-PCR技术检测所筛选出的lncRNA在新鲜肝癌组织及对应癌旁组织中的表达,最终靶定lincRNA-UFC1进行深入研究。接下来本研究利用原位杂交、体内外功能实验、RIP及RNA pull-down等实验明确了lincRNA-UFC1在肝癌中的生物学作用,阐明了其在肝癌发生发展过程中的作用机制,为进一步寻找肝癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的新的分子标志物及靶向治疗提供了理论依据。方法1、lncRNA芯片技术筛选肝癌及癌旁组织中差异表达的lncRNA。利用Arraystar的lncRNA与mRNA芯片技术筛选7对肝癌组织及其配对癌旁组织中的lncRNA及mRNA表达谱,使用独立样本t检验筛选出在肝癌组织与癌旁组织中差异表达lncRNA与mRNA,随机挑选出几个筛选出的差异表达lncRNA与mRNA,利用qRT-PCR的方法检测其在10对肝癌组织及其配对癌旁组织中的表达,验证是否与芯片结果一致,对芯片的结果进行验证。然后扩大样本量,利用qRT-PCR的方法检测49对新鲜肝癌组织及配对癌旁组织中lncRNA的表达,利用独立样本t检验分析lncRNA在肝癌组织与癌旁组织中有无表达差异。2、lincRNA-UFC1在肝癌组织中的表达及在肝癌患者预后中的意义。利用qRT-PCR方法检测49对新鲜肝癌组织及配对癌旁组织中lincRNA-UFC1的表达,采用独立样本t检验分析lincRNA-UFC1在肝癌组织与癌旁组织中表达有无差异。利用原位杂交技术检测131例肝癌石蜡标本及72例癌旁组织石蜡标本中lincRNA-UFC1的表达,并对染色结果进行评分,利用卡方检验分析lincRNA-UFC1在肝癌组织及癌旁组织中表达有无差异。采用Spearman秩相关分析lincRNA-UFC1的表达与肝癌患者各临床病理参数之间的相关性；应用Kaplan-Meier生存分析法与log-rank检验分析lincRNA-UFC1对肝癌患者预后的影响；运用Cox比例风险回归模型对各肝癌患者各临床病理参数、lincRNA-UFC1的表达与肝癌患者预后的关系进行单因素与多因素分析,明确lincRNA-UFC1是否可以作为肝癌发病的独立风险因素。3、lincRNA-UFC1在肝癌中的生物学作用。首先利用qRT-PCR方法检测lincRNA-UFC1在肝癌细胞中的表达水平,筛选出lincRNA-UFC1低表达与高表达的肝癌细胞株。在lincRNA-UFC1高表达的肝癌细胞株中,利用慢病毒干扰技术沉默lincRNA-UFC1的表达或在lincRNA-UFC1表达的肝癌细胞株中过表达lincRNA-UFC1,利用MTT、克隆形成等体外实验及皮下成瘤等体内实验检测lincRNA-UFC1对肝癌细胞增殖的影响,然后利用流式细胞技术、Western blot、免疫组化及TUNEL等技术明确lincRNA-UFC1是否调控肝癌的细胞周期及凋亡。4、探讨lincRNA-UFC1的上游事件。利用生物信息学方法分析可以与lincRNA-UFC1直接结合的：miRNA,并利用双荧光素酶基因报告实验验证两者之间是否可以直接结合。然后采用qRT-PCR方法检测肝癌组织lincRNA-UFC1和该miRNA的表达,证明二者相关性；过表达或表达沉默该niRNA后,放线菌素D处理后,检测lincRNA-UFC1表达变化,进一步明确miRNA调控lincRNA-UFC1的表达及其调控机制。5、探讨lincRNA-UFC1的下游事件。利用RNA pull-down与RNA-RIP技术,确定可以与lincRNA-UFC1直接结合的蛋白质；在lincRNA-UFC1过表达或表达沉默的细胞株中,再通过过表达或沉默该蛋白,观察lincRNA-UFC1的生物学功能是否受到影响,确定lincRNA-UFC1是否通过该蛋白发挥作用。结果1、lncRNA与mRNA在肝癌组织中表达失调。我们利用lncRNA芯片检测7对肝癌组织及其配对的癌旁组织lncRNA和mRNA表达谱,通过聚类分析等方法筛选出在肝癌与癌旁组织中差异表达的lncRNA(与癌旁组织相比在肝癌组织中1493个表达上调和820个表达下调)和mRNA(与癌旁组织相比在肝癌组织中1384个表达上调和1305个表达下调)(该芯片结果已上传至NCBI, GSE58043 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58043)从芯片所筛选出的表达差异IncRNA和mRNA中随机选取10个IncRNA和8个mRNA,应用qRT-PCR方法在10对肝癌组织中进行检测,得出了与芯片一致的结果,这也证明了芯片结果的可靠性。2、lincRNA-UFC1在肝癌组织中高表达且与肝癌患者预后密切相关。我们首先利用qRT-PCR的方法在49对新鲜肝癌组织及其配对癌旁组织中检测lincRNA-UFC1的表达,发现其在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织,差异有显著统计学意义(P<0.01)。Spearman秩相关性分析发现lincRNA-UFC1表达与肝癌患者门脉癌栓(P=0.036)、肿瘤数目(P=0.025)、肿瘤大小(P=0.035)及肝癌巴塞罗那分期(P=0.024)密切相关,而与性别、年龄、病理分级、AFP、肝硬化均无显著相关性。然后利用原位杂交(ISH)的方法检测lincRNA-UFC1在131例肝癌石蜡标本及72例癌旁组织石蜡标本中的表达,结果显示lincRNA-UFC1在肝癌组织中高表达率为68.7%(n=90),在癌旁组织中高表达率仅为23.6%(n=17)。Spearman秩相关性分析发现lincRNA-UFC1表达与肝癌患者门脉癌栓(P=0.021)、包膜(P=0.025)、AFP (P=0.041)、中瘤大小(P=0.013)及巴塞罗那分期(P=0.015)密切相关,而与性别、年龄、病理分级、肝硬化、复发、远处转移及肿瘤数目均无显著相关性。Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验分析结果表明lincRNA-UFC1高表达的肝癌患者总生存时间与无病生存时间较低表达患者总生存时间与无病生存时间短(总生存n=131,P<0.001；无病生存n=131, P<0.001)。Cox比例风险回顾模型进行单因素及多因素分析结果显示lincRNA-UFC1表达(P=0.001)、肝癌复发(P=0.048)、血清AFP (P=0.018)、门脉癌栓(P<0.001)、巴塞罗那分期(P<0.001)及肿瘤大小(P=0.008)均是肝癌患者不良预后的危险因素。Cox逐步回归多因素分析结果表明lincRNA-UFC1表达(95% CI：1.924-5.75；P<0.001)、肝癌复发(95% CI：1.07-2.579；P=0.024)、血清AFP (95% CI:1.033-2.896;P=0.037)、巴塞罗那分期(95% CI：1.017-2.579；P=0.043)及肿瘤大小(95% CI：1.018-2.723；P=0.037)可以作为预测肝癌患者不良预后的独立危险因素。3、lincRNA-UFC1通过诱导肝癌细胞细胞周期的进展及抑制肝癌细胞的凋亡促进肝癌细胞的增殖。首先我们在肝癌细胞SK-Hep1和BEL-7402中过表达lincRNA-UFC1, MTT实验结果显示与对照组相比,过表达lincRNA-UFC1的肝癌细胞增殖能力明显增强；克隆形成实验结果显示与对照组相比,过表达lincRNA-UFC1的肝癌细胞克隆形成能力明显增强。而将肝癌细胞MHCC-97H与Huh7中的lincRNA-UFC1干扰后,结果相反。我们分别将稳定过表达lincRNA-UFC1的SK-Hep1或BEL-7402细胞与对照组细胞接种到裸鼠双侧大腿外侧皮下,利用游标卡尺测量皮下瘤的体积变化,结果显示,过表达lincRNA-UFC1的肝癌细胞皮下瘤的增殖能力与肿瘤重量明显高于对照组。相反的,我们将lincRNA-UFC1稳定干扰的MHCC-97H或Huh7细胞与对照组细胞分别接种至裸鼠双侧大腿外侧皮下,利用游标卡尺测量皮下瘤的体积变化,结果显示,lincRNA-UFC1稳定干扰的肝癌细胞株皮下瘤的增殖能力与重量明显低于对照组。流式细胞技术检测了lincRNA-UFC1过表达的肝癌细胞与对照组细胞的细胞周期,结果发现与对照组细胞相比,SK-Hep1与BEL-7402细胞过表达lincRNA-UFC1后Go/G1期的比例明显下降,而S期的比例明显升高,Western blot结果显示在lincRNA-UFC1过表达的肝癌细胞促细胞周期进展蛋白cyclin D1、 CDK4、CDK6表达增加。相反的,我们将肝癌细胞MHCC-97H和Huh7中lincRNA-UFC1干扰后,流式细胞技术检测细胞周期发现与对照组相比,lincRNA-UFC1表达下调的肝癌细胞Go/G1期的比例明显升高,而S期比例明显下降,Western blot结果显示在lincRNA-UFC1干扰的肝癌细胞中促进细胞周期进展的周期蛋白cyclin D1、CDK4、CDK6表达下降。用5-Fu分别处理稳定过表达lincRNA-UFC1的SK-Hep1、BEL-7402及对照组肝癌细胞株,利用流式细胞技术检测细胞凋亡比例的变化,结果发现,与对照组相比,过表达lincRNA-UFC1的肝癌细胞凋亡比例降低。而将肝癌细胞MHCC-97H和Huh7中lincRNA-UFC1干扰后,流式细胞技术检测细胞凋亡比例的变化,结果发现,与对照组相比,lincRNA-UFC1表达下调的肝癌细胞细胞凋亡比例明显上升,Western blot结果显示在lincRNA-UFC1沉默表达的肝癌细胞中促凋亡蛋白c-PARP、c-caspase3、Bax表达下降。4、lincRNA-UFC1与RNA结合蛋白HuR结合调节β-catenin的表达。我们首先利用qRT-PCR方法分析了23对肝癌组织中lincRNA-UFC1与β-catenin mRNA表达的相关性,发现二者表达水平呈正相关关系(r=0.581,P=0.004)。其次,我们发现在肝癌细胞株中,β-catenin的表达随着lincRNA-UFC1的表达上调而上调,随着lincRNA-UFC1表达下调而下调。lincRNA-UFC1过表达的肝癌细胞β-catenin发生细胞内聚集。我们在肝癌细胞株中过表达lincRNA-UFC1和HuR,通过RNA pull down和RNA-RIP技术,证实lincRNA-UFC1和HuR是直接结合关系。而且,lincRNA-UFC1可以诱导HuR从细胞核向细胞浆的转运。沉默肝癌细胞中HuR的表达可以逆转lincRNA-UFC1对β-catenin表达的调控作用,同时可以逆转lincRNA-UFC1的促增殖作用。提示HuR可能介导了lincRNA-UFC1对β-catenin的调控。5. miR-34a与lincRNA-UFC1直接结合并下调其表达。通过生物信息学方法,我们预测到niR-34a可以与lincRNA-UFC1结合,我们构建荧光素酶基因报告质粒psiCHECK2-lincRNA-UFC1,将miRNA mimics分别与质粒psiCHECK2-lincRNA-UFC 1-wt和质粒psiCHECK2-1 incRNA-UFC1-mut共转染MHCC-97H细胞,miR-34a与质粒psiCHECK2-lincRNA-UFC 1共转染后,荧光信号明显减弱,差异具有统计学意义(P<0.01)。我们将miR-34a mimics导入肝癌细胞后,利用qRT-PCR方法检测lincRNA-UFC1的表达,发现lincRNA-UFC1明显下调。进一步在24对肝癌组织中分析lincRNA-UFC1与niR-34a的表达,发现在肝癌组织中lincRNA-UFC1高表达、miR-34a低表达,二者表达呈负相关关系,具有统计学意义(r=-0.437,P=0.038)。我们将miR-34a mimics转染肝癌细胞,应用放线菌素D处理,结果显示lincRNA-UFC1的半衰期明显缩短。而且过表达miR-34a可以逆转lincRNA-UFC1的促癌作用。由此我们可以推断miR-34a可以通过缩短lincRNA-UFC1的半衰期来调控lincRNA-UFC1的表达水平。结论1、lincRNA-UFC1在肝癌组织中高表达,其可作为预测肝癌患者预后的一个有价值的分子标志物。2、lincRNA-UFC1通过诱导肝癌细胞周期进展及抑制肝癌细胞凋亡促进肝癌细胞增殖。3、lincRNA-UFC1可以与RNA结合蛋白HuR直接结合上调β-catenin的表达,进而促进肝癌细胞增殖。4、miR-34a可以与lincRNA-UFC1直接结合降低lincRNA-UFC1的稳定性,进而下调lincRNA-UFC1的表达。