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小肽转运体POTs (proton-coupled oligopeptide transporters)是质子依赖的转运体,介导一系列短链肽和拟肽类物质的细胞内和细胞间转运。POTs家族由SLC15A基因编码,并由四个成员组成,分别是SLC15A1(PepT1), SLC15A2(PepT2), SLC15A4(PHT1)釉SLC15A3(PHT2)。其中PepT1和PepT2是负责机体内二肽、三肽的细胞摄取的质子偶联的转运体。PepT1属低亲和力,高容量转运体,主要分布于小肠,介导饮食中蛋白质降解产生的二肽、三肽及其它结构相似的化合物的吸收,此外β-内酰胺类抗生素及血管紧张素转换酶抑制剂等药物均是PepT1的底物。与PepT1不同,PepT2属高亲和力,低容量的小肽转运体,其底物识别谱与PepTl相似。PepT2主要分布于肾,肺,脑脉络丛等组织,而在小肠组织中基本没有表达。PHT1和PHT2是后续分别在脑和淋巴系统中发现的另两个小肽转运体成员,其中PHT1主要分布于脑,视网膜等组织,起到吸收神经肽和神经调节因子的降解产物的作用,而PHT2在脾,肺和胸腺等免疫相关组织中有较高mRNA表达,提示其在免疫系统中的作用。PHT1和PHT2除识别二、三肽化合物为底物之外,还介导组氨酸的转运,目前关于PHT1和PHT2的生理功能及调节尚无更多报道。综合以上POTs的各种特性,PepTl和PepT2是非常有优势的拟肽类药物的靶标,PHT2在免疫系统中有重要作用。本文研究了生理和病理状态下POTs在前列腺组织及细胞中的表达及PepT2在前列腺的分布,评价其作为药物吸收的靶标的意义。本文还研究了PepT2在NOD1(核苷酸结合寡聚域样受体1)和NOD2(核苷酸结合寡聚域样受体2)信号通路中的作用,以及炎症刺激对脾脏及巨噬细胞中PepT2和PHT2表达和功能的影响。1.小肽转运体POTs在前列腺中的表达研究采用Western Blot和Real-time PCR的方法,考察PepTl, PepT2, PHT1和PHT2在小鼠前列腺中mRNA和蛋白表达,结果显示PepT2和PHT1在前列腺中mRNA表达较高,但仅有PepT2蛋白显示免疫条带。以免疫组化方法对PepT2在小鼠前列腺组织的表达进行定位研究发现,PepT2主要在前列腺上皮细胞顶侧表达,在基底细胞中也略有表达。为更好地了解PepT2在前列腺中表达的生理意义,本文考察了不同年龄小鼠前列腺组织中PepT2的mRNA和蛋白表达,结果发现在小鼠发育阶段,PepT2mRNA和蛋白表达均随周龄增大而增加,而达到成年(8周龄)后趋于平稳,表明PepT2在性成熟的前列腺中发挥作用。人前列腺组织中POTs的mRNA表达研究结果发现,PepT2和PHT2mRNA表达水平较高,PHT1较低,而PepTl基本没有检测到。对16例前列腺增生和前列腺癌的临床样本的POTs表达的比较研究,前列腺癌样本中PepT2的mRNA和蛋白表达水平均显著低于前列腺增生样本,且前列腺癌样本中PHT1mRNA表达也显著低于增生样本,推测肿瘤环境可能影响PepT2和PHT1的表达。人前列腺上皮细胞RWPE-1和人前列腺癌细胞PC-3细胞中有较低的PepT2,PHT1和PHT2的表达。为考察炎症环境对POTs表达的影响,本文以致炎因子IFNγ和TNFa诱导刺激细胞产生炎症反应后,检测细胞中PepT2, PHT1和PHT2的mRNA表达变化,结果显示IFNy (50ng/mL)和TNFa (50ng/mL)刺激RWPE-1细胞48小时后,显著诱导PHT2mRNA表达(P<0.001),但却使PepT2表达降低(P<0.01),而在PC-3细胞中,IFNy (50ng/mL)和TNFa (50ng/mL)作用48h后,PHT2mRNA表达均显著增加(P<0.001),但对PepT2和PHT1的表达无显著影响(P>0.05). PHT2在RWPE-1和PC-3细胞中的基础表达均较低,而致炎因子的刺激作用显著诱导了PHT2的表达,表明炎症因子显著上调PHT2表达,提示其在细胞免疫应激中可能有重要作用。2.小肽转运体POTs在小鼠脾脏中的表达分布及在脾巨噬细胞中转运功能研究本章研究了小肽转运体PepT1,PepT2,PHT1和PHT2在小鼠脾脏中的mRNA和蛋白表达,结果显示PepT2和PHT2在小鼠脾脏中表达较高。为考察PepT2和PHT2在脾脏中的分布和生理功能,本研究以贴壁培养法分离了脾脏淋巴细胞和巨噬细胞,分别考察其中PepT2和PHT2表达,结果表明,PepT2主要在巨噬细胞中表达,而PHT2在淋巴细胞和巨噬细胞中均有相当水平的表达。POTs的荧光底物β-Ala-Lys(AMCA)在小鼠脾巨噬细胞的积聚研究显示,其积聚呈pH依赖性,在pH为6.0时积聚最强,β-Ala-Lys(AMCA)的积聚动力学显示其在脾巨噬细胞中积聚符合米氏方程,其Km=75.5±15μM,Vmax=25.4±2.1pM/min per mg protein。POTs的其它经典底物(抑制剂),如肌肽,Gly-Sar,头孢氨苄均显著抑制β-Ala-Lys(AMCA)(50μM)在脾巨噬细胞内的积聚(P<0.01),而组氨酸(PHT1和PHT2底物,非PepTl和PepT2底物,5mM)未能明显改变β-Ala-Lys(AMCA)在细胞内积聚；此外,POTs经典底物Gly-Sar在脾巨噬细胞中积聚也被POTs底物肌肽(5mM)明显抑制,而组氨酸对其没有影响。上述结果表明PepT2,而非PHT2介导脾巨噬细胞对POTs底物的摄取。3.小肽转运体POTs在NoD1,NOD2信号通路中的作用NOD1和NOD2是固有免疫反应中的两个重要的细胞内信号受体,分别可识别y-iE-DAP和MDP为配体,激活NF-κB活性,调节多种基因的表达,产生炎症因子。本章以小鼠脾巨噬细胞和THP-1巨噬细胞为研究模型,考察PepT2在y-iE-DAP和MDP诱导的NOD1和NOD2信号通路中的作用。结果显示,在小鼠脾巨噬细胞中,PepT2底物及抑制剂肌肽(5mM)显著抑制y-iE-DAP (l0μg/mL)和MDP(l0μg/mL)诱导的炎症因子IL-6和TNFa mRNA表达的增加(P<0.05),但不影响IL-6和TNFa的细胞外蛋白分泌,提示PepT2参与y-iE-DAP和MDP的入细胞过程,影响NOD1和NOD2信号通路,而不影响炎症因子的可溶性分泌。小肽转运体POTs在三株巨噬细胞系中表达情况各异,其中J774a.1细胞中仅PHT2有较高表达,THP-1细胞中PepT2, PHT1和PHT2均有较高表达,而在RAW264.7细胞中四个转运体表达均较低,因此本文以THP-1巨噬细胞为研究模型进一步验证PepT2在NOD1和NOD2信号通路中的作用,结果表明在THP-1细胞中y-iE-DAP (10μg/mL)诱导增加IL-6和TNFa的mRNA表达,且肌肽(5mM)和组氨酸(5mM)均显著抑制y-iE-DAP对IL-6(P<0.01)和TNFa (P<0.05)的诱导作用,表明PepT2在THP-1细胞中也参与NOD1信号通路,而组氨酸的对NOD1信号通路激活的抑制效应机制有待进一步研究。PepT2介导NOD1和NOD2配体y-iE-DAP和MDP的转运,间接参与NOD1/2信号通路。4.脂多糖致炎对巨噬细胞和小鼠体内POTs的表达的影响小肽转运体POTs的表达和功能受多种因素调节,本章以内毒素脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞及小鼠致炎模型考察了炎症刺激对POTs mRNA表达的影响,结果显示在两种细胞中给予LPS (10ng/mL)刺激2小时后,PepT2和PHT1表达没有显著变化,但PHT2表达明显增加(THP-1巨噬细胞：P<0.01, J774a.1细胞：P<0.001),该结果与前列腺细胞中的研究结果一致,此外LPS致炎的小鼠体内脾肺等组织POTs表达均增加3-5倍表明炎症刺激上调PHT2表达,提示PHT2可能在免疫应激中发挥重要作用。根据文献报道,PepTl和PepT2为细胞膜上的跨膜蛋白,而PHTI和PHT2主要定位于细胞质内溶酶体等细胞内膜系统中,细胞受到炎症刺激时,PHT2表达的明显增加可能发挥将溶酶体中消化产生的降解产物转运出溶酶体的作用。