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1研究背景与目的随着中国经济的高速发展、城市化进程的加快以及汽车占有量的大幅增加,大气污染日趋严重,已成为影响居民健康的主要危险因素之一。颗粒污染物是城市大气污染的主要污染物,大量研究结果表明空气污染物中的可吸入颗粒物可对心血管系统产生不良的影响。柴油机排放颗粒物(diesel exhaust particle,DEP)中主要为(27)2.5mm的颗粒,研究发现长期吸入DEP与急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)发病率和死亡率的升高有关,并认为这可能是由于DEP中的超细颗粒物(ultrafine particles,UFPs)穿透气血屏障进入血液循环和脉管系统,进而引起血管和心肌产生前炎性效应、氧化应激效应以及全身炎症反应相关的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块的形成及破损所致。炎性反应主要通过参与白细胞聚集、免疫黏附分子高表达、泡沫细胞和粥样斑块形成等过程促进动脉粥样硬化的发生发展。炎性反应产生的细胞因子可促进脂质在动脉内膜下沉积,加速单核细胞进入血管内皮参与斑块形成以及刺激动脉中膜平滑肌增生致斑块破裂。此外,单核细胞在吞噬氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density protein,ox-LDL)后可大量粘附在内皮细胞上,并进一步移入内膜下形成巨噬细胞,作为氧化因子诱导氧化应激损伤血管平滑肌细胞和内皮细胞。单核-巨噬细胞被激活、发生呼吸爆发而生成大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),过多的ROS可通过增加内皮细胞钙离子水平导致内皮细胞功能失调/凋亡、血管收缩性改变,最终致斑块破裂导致急性冠状动脉综合征的发作。由上可知,以单核细胞为主的炎性反应在DEP发挥毒性作用(如诱发ACS加重)方面起着重要作用,但DEP对人单核细胞的炎性作用机制尚未完全阐明。本研究分别检测DEP对ACS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)和人单核细胞株THP-1炎性因子表达的影响,探讨ACS患者PBMC对DEP所致的炎性效应是否敏感以及DEP诱导单核细胞炎性因子高表达的分子生物学机制。本研究将为阐明DEP对人单核细胞的炎性作用及其机制,识别敏感人群提供重要实验依据。2研究方法2.1选择ACS病人为病例组,健康人为对照组,密度梯度离心法提取PBMC,不同浓度DEP刺激后,检测培养上清中LDH的酶活力,酶联免疫吸附测定的实验方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测PBMC培养上清中白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、白介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的含量。2.2不同浓度的DEP刺激人单核细胞株THP-1后检测培养上清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量。2.3应用流式细胞仪测定不同浓度DEP刺激THP-1后ROS的水平。2.4 Western blot方法检测DEP刺激THP-1后EGFR磷酸化水平。2.5分别用抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine,NAC)、或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制剂(PD153035)预处理细胞后,用上述ELISA方法检测抗氧化剂或EGFR抑制剂对DEP诱导IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达的影响。3研究结果3.1 DEP刺激可增加人PBMC炎性因子的表达:随着DEP浓度的增加,PBMC释放IL-1β和TNF-α的量也随之增高,其中以50μg/m L组水平最高(P<0.05);IL-8的量随着DEP刺激浓度的增加也随之增加,其中以100μg/m L组水平最高(P<0.05);在同一DEP浓度下,ACS患者PBMC中IL-1β、IL-8和TNF-α的相对增加量较来自对照组PBMC的高。THP-1细胞的实验结果与人原代PBMC结果相似,也表现为随着DEP刺激浓度的增加,THP-1释放IL-8、TNF-α的量也随之增高,其中以100μg/m L组水平最高(P<0.05)。3.2 ROS在DEP诱发单核细胞炎性因子表达中的作用:用20 m M NAC预处理THP-1细胞,分别检测NAC对DEP诱导细胞ROS生成及炎性因子表达的影响。结果显示,NAC可明显降低DEP所致ROS的生成以及炎性因子IL-8和TNF-α的表达(P<0.05)。3.3 EGFR在DEP诱发单核细胞炎性因子表达中的作用:用1 m M EGFR抑制剂PD153035预处理THP-1细胞,检测PD153035对DEP诱导细胞炎性因子表达的影响,结果显示,PD153035可明显降低DEP所致IL-8的表达(P<0.05)。4结论4.1 DEP刺激PBMC可诱导IL-1?、IL-8和TNF-α高表达;4.2 ACS患者的PBMC与对照组相比对DEP刺激的炎性反应更敏感;4.3 DEP刺激THP-1可诱导IL-8和TNF-α的高表达;4.4 DEP可诱导THP-1产生过量ROS和EGFR活化,两者参与DEP所致的IL-8和TNF-α的高表达。