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研究目的:多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)作为中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的炎症性疾病,其主要病理特征为炎性细胞浸润和白质脱髓鞘。该病常发生于青壮年,与病毒感染、遗传、环境等因素可能有着密切关系。由于该疾病目前的发病机理尚不明晰,且该病给患者带来不可逆的生理及心理损害,故暂无特效治疗方法,仅有一些售价高昂的缓解期的非特异性治疗药物。因此,目前研究的关键是明确MS的发病机制。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是经典免疫动物模型之一,是通过向实验动物注射抗原蛋白进行免疫来构建的。其发病症状和病理表现与MS相似,故被广泛应用于研究MS发病机制。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)与机体的免疫反应和免疫耐受息息相关。DC将抗原呈递给T细胞,激活T细胞的炎症应答和分化,在MS的发病中起到关键作用。而耐受性DC是一种具有免疫耐受性能的未成熟细胞,它可能成为治疗MS的新靶点。髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)通过Toll样受体(Toll like receptor,TLR)连接下游蛋白,介导适应性免疫,促进炎性蛋白的表达。MyD88可通过连接TLR和核转录因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)刺激DC成熟。故本研究中将探究MyD88在从EAE模型鼠提取并诱导的DC中RNA和蛋白水平的表达量,并采用短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)干扰技术靶向沉默MyD88,尝试诱导出耐受性DC,并将该类型耐受性DC回输至EAE模型鼠,进一步探讨MyD88在EAE模型中的可能作用和MyD88沉默的耐受性DC对EAE的治疗价值。研究方法:1.采用髓鞘少突胶质糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55多肽与完全弗氏佐剂(Complete freund’s adjuvant,CFA)、灭活结核分支杆菌H37Ra充分混合后,免疫C57BL/6雌性小鼠,并在注射完毕后和48小时后向小鼠腹腔注射百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX),构建EAE动物模型;2.由小鼠腿骨(胫骨和股骨)提取出骨髓来源的单个细胞悬液,加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(Interleukin-4,IL-4)诱导细胞向DC分化;3.提取DC的RNA和蛋白,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和Western Blot蛋白免疫印迹法检测MyD88表达水平;4.采用shRNA技术靶向沉默DC中MyD88基因,通过RT-qPCR检测MyD88表达,诱导耐受性DC,并通过流式细胞术检测所获得的耐受性DC的表面分子表达和细胞因子分泌情况。同时加入脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激耐受性DC后,再次检测表面分子表达和细胞因子分泌水平;5.将获得的耐受性DC分三次回输给EAE动物模型,进行评分和观察。在高峰期,检测血清细胞因子分泌情况。同时制作脊髓切片,进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色和固蓝(Luxol fast blue,LFB)染色,观察脊髓炎性细胞和脱髓鞘空泡变化。研究结果:1.MOG35-55多肽与CFA、H37Ra充分混匀后,注射给C57BL/6雌性小鼠,并在注射完毕后和48小时后向小鼠腹腔注射PTX,可以成功构建EAE动物模型;2.骨髓提取出的单个细胞悬液在加入GM-CSF和IL-4诱导后培养,通过流式细胞术检测,验证得到的细胞为DC细胞;3.EAE模型中DC的MyD88在RNA和蛋白水平的表达量均高于普通野生型DC;4.采用shRNA干扰技术靶向沉默DC中的MyD88基因后,检测发现MyD88在RNA水平的表达量降低。且DC表面分子表达量有一定变化:CD80表达升高,CD86、主要组织相容性复合物II(Major histocompatibility complex II,MHC II)表达降低,DC分泌IL-4的水平增高。加入LPS刺激后,DC表面分子CD274,即程序性死亡受体配体1(Programmed death 1 ligand,PD-L1)表达升高,但升高水平较野生型DC偏低,细胞因子的分泌情况与正常野生型DC无明显差异;5.回输正常野生型DC和靶向沉默MyD88的DC至EAE模型鼠后,实验动物的症状及评分均有所缓解。但在高峰期血清细胞因子的检测中,仅有野生型DC回输组中IL-2的分泌水平较PBS组有所下降。脊髓病理染色结果显示,两组DC回输组的炎性细胞浸润较PBS组减少,脱髓鞘空泡较少,但两组之间并无明显差异。结论:1.通过MOG35-55多肽蛋白可以成功免疫C57BL/6雌性小鼠,构建EAE动物模型;2.EAE模型小鼠的DC中MyD88在RNA和蛋白水平的表达较野生型小鼠DC升高;3.shRNA慢病毒载体转染技术可靶向DC中MyD88基因,可在体外成功诱导出耐受性DC;4.向EAE模型小鼠回输MyD88-shRNA诱导的DC,能减轻其症状、脊髓中炎性细胞浸润情况和髓鞘脱失现象;5.shRNA靶向沉默MyD88诱导的耐受性DC对EAE有一定治疗作用,但并不优于野生型DC回输的治疗作用。