一、背景胆道并发症严重影响肝移植受体的生存及生活质量,被公认为肝脏移植的薄弱环节(Achilles’heel)。随着人们对胆道并发症认识的深化和外科吻合技术的提高,由外科技术原因造成的胆管吻合口并发症及引流管相关性并发症的发病率呈下降趋势,而以非外科技术因素导致的胆道并发症仍然是制约肝脏移植远期疗效的主要因素之一。以弥漫性移植物胆管树狭窄、扩张、毁损为病理特征的非吻合口狭窄(Nonanastomotic biliary strictures, NAS)是非外科性移植物胆管并发症的主要类型。文献报道NAS好发于肝门部和肝内一至三级的大胆管,发生率为5%-15%。移植肝NAS的发生是一个多因素、多环节的复杂过程。冷保存/再灌注损伤(Cold preservation repefusion injury, CPRI)能导致或加重移植肝胆管损伤,是NAS发生的主要原因之一。正常生理情况下,胆管上皮细胞微环境中即存在许多损伤因素,如胆汁中的疏水性胆盐、细菌毒素等,同时也存在多种保护措施拮抗这些损伤因素,如胆管周围血供十分丰富,能及时为上皮细胞提供充足的能量,清除代谢产物;胆汁中磷脂及亲水性胆盐能拮抗疏水性胆盐的细胞毒性;胆管上皮细胞表达粘蛋白,其对胆管上皮起润滑、保护作用。研究提示冷保存/再灌注损伤不仅能导致胆管上皮细胞骨架破坏、ATP耗竭及炎性受损,而且能打破胆管上皮细胞微环境中损伤因素和保护措施间的平衡。冷保存/再灌注损伤可导致胆管周围血管丛微循环障碍,使上皮细胞能量供应障碍,代谢产物蓄积;还可致胆汁中胆盐/磷脂比明显升高,加重了胆盐的细胞毒性,即“毒性胆汁”学说。粘蛋白是一类大分子量糖蛋白,主要表达在消化道、呼吸道、泌尿生殖道及其他一些组织粘膜表面,分为跨膜型粘蛋白和分泌型粘蛋白。粘蛋白的主要功能是保护粘膜上皮细胞免受物理、化学、生物等各种因素损伤,其表达减少或缺失能减弱粘膜上皮对各种损伤因素的抵抗能力,加重粘膜受损。粘蛋白表达具有组织和疾病特异性,其质和量改变与多种疾病进展相关。胆管上皮细胞表达粘蛋白,正常生理情况下保护上皮免受各种损伤因素损害。其表达改变与多种胆管良、恶性疾病发生和进展相关。而肝移植后胆管粘蛋白表达是否发生改变及其可能的作用目前还未见报道。综合近年来国内外的研究结果,我们提出了以下实验设想:在经历CPRI后,移植肝胆管粘蛋白表达降低,减弱了其对胆管上皮的保护作用,加重胆管损伤。显然,如果我们能对该假说加以验证,必将拓宽对CPRI导致移植肝NAS发生机制的认识,也有助于拓展新的预防和治疗策略。二、目的本实验采用重建肝动脉血供的大鼠原位肝移植胆道外引流模型,主要研究冷保存/再灌注损伤能导致移植肝胆管哪些粘蛋白发生何种改变,并且初步探讨其与胆管损伤的相关性。最后寻求一种理想的体外模型以便于今后相关机制的研究。三、方法和结果1.正常SD大鼠胆管粘蛋白表达情况。取正常SD大鼠肝脏(n=5),通过酶灌注联合机械分离的方法获取胆管组织,以三级分支末端为界分为大、小胆管。采用Real-Time PCR、免疫组化和Western blotting等方法检测粘蛋白表达情况。正常SD大鼠大胆管表达Muc1、Muc2、Muc3A、Muc4、Muc6 mRNA,小胆管仅表达Muc1、Muc2、Muc3A、Muc4 mRNA,且表达量均显著低于大胆管。大、小胆管均不表达Muc5AC mRNA。Muc1和Muc4蛋白主要表达于胆管上皮细胞顶侧胞膜,其大胆管表达量均显著高于小胆管,与mRNA结果一致。以上结果提示粘蛋白主要表达于大胆管。2. CPRI对大鼠移植肝胆管粘蛋白表达的影响。采用重建肝动脉血供的大鼠原位肝移植胆道外引流模型,大鼠随机分为对照组(A组)、冷保存1小时组(B组)和冷保存12小时组(C组)。术后1、3、7、14天取标本。取材时先取一小叶肝脏标本用于组织学检测,然后通过酶灌注联合机械分离的方法获取胆管组织。采用Real-Time PCR和Western blotting检测粘蛋白表达情况。Real-Time PCR结果显示,与A组相比, B、C组Muc1、Muc3A和Muc4 mRNA术后先显著降低,后逐渐恢复。B、C组比较发现,冷保存时间越长,其mRNA水平越低,恢复越慢。B、C组Muc2和Muc6 mRNA在大部分时相点与A组无显著差别。Western blotting结果显示B、C组Muc1和Muc4蛋白表达情况与基因水平一致。因缺乏抗大鼠Muc3A商业抗体,本实验中未检测Muc3A蛋白水平情况。3.大鼠肝移植胆管粘蛋白降低与胆管损伤相关性分析。利用组织损伤病理评分(BDISS)评估移植肝大、小胆管损伤严重程度。测量移植肝胆汁碱性磷酸酶(ALP)和谷氨酰转肽酶(γ-GT)浓度。等级相关性分析提示C组胆管粘蛋白Muc1和Muc3A水平与大胆管BDISS显著负相关,而与小胆管BDISS不相关。线性相关性分析提示各组胆管粘蛋白水平与胆汁ALP和γ-GT浓度变化均不相关。4.冷保存对体外培养的SD大鼠胆管粘蛋白表达影响。取SD大鼠大、小胆管组织分别在体外鼠尾胶原中三维培养,实验分为对照组(Ⅰ组)、冷保存1小时组(Ⅱ组)和冷保存12小时组(Ⅲ组)。采用Real-Time PCR和Western blotting分别检测粘蛋白Muc1、Muc3A和Muc4 mRNA和蛋白表达情况。Ⅲ组大胆管Muc1、Muc3A和Muc4 mRNA较Ⅰ组显著降低。Muc1、Muc4蛋白变化与基因水平一致。以上结果与动物实验结果一致。四、结论1.正常SD大鼠胆管表达粘蛋白Muc1、Muc2、Muc3A、Muc4和Muc6,且主要表达于大胆管。2.肝移植后,移植肝胆管粘蛋白Muc1、Muc3A和Muc4表达显著降低,且供肝冷保存时间越长,其表达量越低,恢复越慢。3.肝移植后,供肝长时间冷保存导致的移植肝胆管粘蛋白Muc1和Muc3A表达水平降低与大胆管损伤的组织病理严重程度显著相关,提示长时间冷保存/再灌注损伤导致的移植肝胆管粘蛋白Muc1和Muc3A表达水平降低可能在大胆管损伤中发挥作用。4.应用胆管组织培养体外模型能得到与动物实验一致的结果,提示胆管组织培养是研究冷保存/再灌注损伤对胆管粘蛋白表达影响较理想的体外模型。