背景与目的高胆固醇血症是心血管疾病（CVD）的重要危险因素之一,高胆固醇血症引起的内皮细胞（ECs）稳态受损是代谢性血管疾病发生的第一步,然而目前高胆固醇血症对ECs稳态的调控机制知之甚少。本课题组前期诱导斑马鱼发生高胆固醇血症后,测序发现其可以引起一系列线粒体相关蛋白表达紊乱,其中包括电子转移黄素蛋白α（ETFα）,它介导脂肪酸β氧化过程中的电子向呼吸链传递。本研究拟探讨ETFα表达减少与心血管相关疾病之间的关系,并藉此寻找CVD治疗的新靶点,同时为研究胆固醇与血管发育调控的新机理做出贡献。方法1.分别使用不同胆固醇浓度（0%、4%、6%、8%、10%）饲料喂养5dpf斑马鱼10天,建立高胆固醇血症斑马鱼模型,观察斑马鱼大体及局部血管情况。2.通过RT-q PCR检测普通饲料组及不同浓度HCD组的ETFA、HIF1等基因的表达水平。3.提取斑马鱼总细胞,通过流式细胞术分选自带绿色荧光的内皮细胞,用Flow Jo软件分析并统计内皮细胞含量;分选好的ECs行转录本测序并分析。4.采用4个基因的MO进行斑马鱼胚胎显微注射,对比血管发育表型差异制定观察血管新生的统计方法。5.通过收集不同注射浓度的24及48hpf ETFA MO斑马鱼,PCR检测ETFA转录本有无剪接或减少,并通过荧光显微镜观察不同浓度斑马鱼血管发育情况。6.利用反义吗啉环寡核苷酸（Morpholino,MO）显微注射野生型ABSR品系或内皮细胞标记增强的绿色荧光蛋白Tg（Flk1:e GFP）品系斑马鱼胚胎,统计斑马鱼在24h和48h的死亡率并分别观察8h、24h、32h的斑马鱼大体发育情况。7.通过MO注射Tg（Flk1:e GFP）品系斑马鱼,透过荧光显微镜观察斑马鱼32h与48h的血管发育,并在两个时间点分别根据节间血管的发育程度或节间血管与背侧纵向吻合血管的连接根数来评价血管发育状态。8.在PCS2+-m Cherry质粒上通过SP6启动子合成外源性斑马鱼ETFA m RNA,分别稀释成不同浓度（50、100、200、500pg/nl）ETFA m RNA与5ng/ul ETFA MO共同显微注射Tg（Flk1:e GFP）品系斑马鱼胚胎行拯救实验,观察血管发育情况,并通过western blot检测ETFA蛋白水平、RT-q PCR检测HIF1基因水平。9.使用7-酮基胆固醇（7-keto）模拟内皮细胞损伤模型,并通过梯度浓度的蛋白酶体抑制剂MG132刺激内皮损伤模型,Western blot检测这两种模型中ETFα的蛋白表达水平;并利用慢病毒转染敲低HUVECs的ETFA,通过显微镜拍摄并定量分析3-6小时内的细胞成管能力。10.验证ETFA sh RNA慢病毒转染后HUVECs迁移与增殖能力:在6孔板中行划痕实验,加入或不加入细胞增殖抑制剂丝裂霉素C（MMC）,拍摄并统计0h、12h、20h细胞划痕愈合面积的大小;在transwell小室中重新铺板细胞,12h后处理、拍摄并统计迁移细胞的数量;使用Edu流式技术检测细胞增殖情况。11.验证ETFα对于线粒体功能和细胞代谢的影响:Sea Horse XF分析仪分别测定在正常与抑制脂肪酸氧化（FAO）的条件下,ETFA sh RNA转染的HUVECs对于外源和内源脂肪酸（FAs）的相对利用率及基础呼吸及最大呼吸时的耗氧率（OCR）的变化。并通过ATP试剂盒检测ETFA敲低后的ATP含量。12.在常氧条件下,使用乙酸盐（acetate）行ETFA敲低的HUVECs的挽救实验,western blot检测ETFA敲低的HUVECs的ETFα及HIF1α蛋白水平;在缺氧条件下,western blot检测ETFA敲低的HUVECs的ETFα及HIF1α蛋白的表达。结果1.高胆固醇饮食影响15dpf斑马鱼的体长及其尾部血管发育。大体观察发现,10%HCD组斑马鱼幼鱼体长明显缩短（P＜0.01）;荧光显示图表示6%、8%、10%HCD组尾鳍血管的长度以胆固醇浓度依赖性降低（P＜0.00001）;经过统计,8%和10%HCD组尾鳍血管数量减少,10%HCD组减少尤为明显（P＜0.00001）。2.高胆固醇饮食降低ETFA、HIF1的基因水平。RT-q PCR结果显示,与普食组相比,HCD组ETFA呈现出随着胆固醇浓度的增加而降低的趋势（P＜0.01）,HIF1基因在6%和10%HCD组同样被下调（P＜0.00001）。3.高胆固醇饮食组内皮细胞含量降低。与普通饮食组比较,ECs在HCD组可出现含量降低的趋势,8%HCD组统计学差异较明显（P＜0.01）。4.血管发育表型的基因差异性。影响血管发育的基因可明显抑制血管新生的萌芽,ISVs严重受损甚至萌芽失败,对血管发育无明显的影响或发育状态不良的基因不纳入血管发育评判标准。5.斑马鱼ETFA MO有效性及浓度的探索。PCR结果显示,与0.5、2.5ng/ul相比,5ng/ul ETFA MO可有效降低ETFA的表达,同时在斑马鱼中可出现血管缺陷表型最明显。6.ETFA MO导致斑马鱼高死亡率及不同类型的畸形。24h与48h ETFA MO组斑马鱼死亡率高于空白组、对照MO组（P＜0.01）,而对照MO组死亡率在48h存在统计学差异（P＜0.01）;在8h、24h、32h分别与空白组的斑马鱼明场图对比,ETFA MO组出现发育延迟且不同类型的畸形如血管发育缺陷、体型短小、脊柱弯曲及尾部卷曲等,其中血管发育缺陷在畸形占比中高达80%（P＜0.00001）。7.干扰斑马鱼ETFA表达后导致其血管发育缺陷。32hpf ETFA MO组的完整ISVs数量明显少于空白组和对照MO组（P＜0.00001）。48hpf斑马鱼在轻度、重度缺陷的统计中ETFA MO组与空白组（P＜0.01）、对照MO组（P＜0.001）均有统计学差异;同时在完整ISVs数量定量分析显示,ETFA MO组存在血管根数严重缺陷的现象（P＜0.00001）。8.ETFA MO致血管缺陷表型可被外源性ETFA m RNA成功挽救,同时HIF1的表达水平也可被部分挽救。与空白组、对照MO组相比,单纯注射ETFA MO组的ISVs受损有统计学差异（P＜0.001）,而50pg/nl和100pg/nl的ETFA m RNA+ETFA MO共同注射组与ETFA MO组存在统计学意义（P＜0.01）,200pg/nl及500pg/nl m RNA挽救效果最佳;western blot显示ETFA m RNA+ETFA MO组成功挽救ETFα的表达;RT-q PCR表示,与空白组、对照MO组相比,ETFA MO组HIF1水平明显下降（P＜0.00001）;ETFA m RNA+ETFA MO组较空白组（P＜0.01）、对照MO组（P＜0.0001）降低,但较ETFA MO组稍高（P＜0.01）。9.Ox LDL和ETFA sh RNA均可降低HUVECs中的ETFα蛋白及细胞成管功能。Western blot表明7-keto呈浓度依赖性降低内皮细胞ETFα蛋白水平,而MG-132对7-keto引起的ETFα的下降无明显改变;镜下观察7-keto内皮损伤组和ETFA sh RNA组小管形成能力下降,且小管总长度及连接处节点较空白组、对照sh RNA组明显减少,具有统计学差异（P＜0.00001）。10.ETFA sh RNA导致HUVECs迁移及增殖能力水平降低。划痕实验表明,正常情况下,ETFA sh RNA组较空白组、对照sh RNA组可明显抑制HUVECs的迁移（P＜0.01）,MMC存在时仅出现空白组与对照sh RNA组迁移能力下降（P＜0.01）;transwell实验表明,ETFA sh RNA组较对照sh RNA组的细胞迁移能力降低（P＜0.001）,但与空白组比较差异更显著（P＜0.00001）;Edu增殖实验表明,与空白组、对照sh RNA组比较,ETFA sh RNA组细胞增殖能力下降（P＜0.001）。11.ETFα参与影响线粒体脂肪酸氧化。ETFα敲低后正常状态下基础呼吸耗氧率降低（P＜0.01）,且最大呼吸下降尤为显著抑制（P＜0.0001）;加入FAO抑制剂后,与对照组相比,基础呼吸下降（P＜0.001）,但最大呼吸下降更为显著（P＜0.00001）。加入外源性FAs后,与正常组及加入FAO抑制剂组相比,敲低ETFα的基础呼吸下降（P＜0.00001）,且最大呼吸没有增加（P＜0.01）。ETFA敲低后的HUVECs内的ATP含量减少（P＜0.01）。12.ETFα的缺失影响HIF1α蛋白水平的稳定。正常氧条件,与空白组相比,ETFA sh RNA组的ETFα蛋白被慢病毒在24h及48h都稳定敲低（P＜0.001）,在48h与对照sh RNA组比较差异性更为明显（P＜0.00001）,而acetate无法挽救ETFα的下调;在缺氧条件下,48h的空白组与对照sh RNA组的HIF1α蛋白水平较24h相比均升高（P＜0.01）;与空白组、对照sh RNA组相比,ETFA sh RNA组48h明显降低HIF-1α蛋白表达（P＜0.01）。结论高胆固醇血症中ETFα的下调抑制内皮增殖和迁移与斑马鱼的血管发育缺陷有关。内皮细胞中ETFα下调诱导氧稳态紊乱导致的HIF1α是高胆固醇血症诱导的血管功能障碍的机制之一。