呼吸系统感染在世界范围内普遍存在，各年龄段人群都可易感，造成了严重的疾病负担。引起呼吸系统疾病的病原中大多是病毒，如人冠状病毒、呼吸道合胞病毒和人腺病毒等。全球范围内，每年约有1060万例脑膜炎病例，其中28.8万例死亡，大多发生在发展中国家。目前已知有100多种细菌和病毒可引起脑膜炎。快速准确鉴定感染病原类型对于有效控制病原体的传播、临床治疗方案的确定和疾病预后的改善起到了至关重要的作用。临床常用的病毒检测方法包括核酸检测（如聚合酶链式反应）和免疫学检测（如酶联免疫吸附测定）。这些方法仅能针对特定的病原，存在检测病原种类少、无法检测未知病原等问题。高通量测序技术是核酸测序的一项革命性技术创新,为基因组学和后基因组学研究带来了新的科研方法和解决方案，在病毒基因组测序的研究中具有快速、准确、需要的样本量少、无需提前预知病毒基因组序列等优点，但其效果受到宿主核酸和临床样本中的病毒载量的影响。高通量测序技术以样本中所有的遗传物质为研究对象，快速准确地鉴定出样本的病原组成，突破了传统病毒检测方法的局限。
　　研究目的：
　　本研究以基因组最大的RNA病毒-人冠状病毒为例，比较了不同宿主核酸去除方式对纯培养样本中HCoV-OC43高通量测序结果的影响；并且比较了呼吸道样本中不同病毒载量的HCoV-NL63在不同宿主核酸去除方式和不同测序数据量下结果的差异；评估了常用于病毒基因组学研究中的SISPA的准确性和灵敏性，为快速高效地从不同来源的样本中获得人冠状病毒基因组提供切实可行的方案。同时为其它呼吸道RNA病毒基因组序列的获得提供参考依据。
　　中枢神经系统感染样本诊断试剂盒MeningoFinder?2SMART可同时检测多种病原，耗时少。但其只检测特定的病原，对于病因不明的脑膜炎病例效果欠佳。选择诊断为感染性脑膜炎患者的脑脊液样本，一份由试剂盒检测定性，一份通过高通量测序技术进行测序，观察感染性脑膜炎患者的病原谱特征和两种检测方法结果的差异，为脑膜炎患者的病原诊断提供参考。
　　研究方法与结果：
　　一、HCoV-OC43细胞培养样本高通量测序方法优化和SISPA效果评价
　　HCoV-OC43的细胞培养样本分为对照、前处理、后处理和前&后处理四种不同的宿主核酸去除方式，将经过不同处理方式获得的核酸分为两份，一份进行RNA的直接建库测序，另一份经过序列非依赖的单引物扩增（SISPA）后进行DNA建库测序。结果表明：对于人冠状病毒的细胞培养样本，后处理组的核酸直接进行RNA建库测序能快速准确获得病毒的全基因组序列。SISPA的扩增准确性好。
　　二、HCoV-NL63的呼吸道样本高通量测序方法优化和其系统发生分析
　　选择不同HCoV-NL63载量的呼吸道样本，分为对照组、前处理组、后处理组和前&后处理组，将经过不同处理方式获得的核酸进行SISPA扩增，对获得的扩增产物进行DNA建库测序。结果表明：四种宿主核酸去除方式中，前&后处理组效果最好。SISPA对临床样本中载量较低的人冠状病毒效果不佳。提高测序数据量可有效提高获得的病毒reads和基因覆盖率，但对于载量较低的人冠状病毒无显著效果。
　　对本实验中获得两条HCoV-NL63序列进行基于全基因组和S基因的系统发生分析，结果表明：本实验中的序列位于进化树单独的分支上，且与C型较为接近，认为其同属于C型。与之前的国内株（D型）不属于相同亚型。
　　三、感染性脑膜炎样本的病原分析和与脑脊液样本检测试剂盒的结果比较
　　选择诊断为感染性脑膜炎患者的脑脊液样本，通过MeningoFinder?2SMART试剂盒和高通量测序技术测序，结果表明：本次实验的样本中检出阳性率最高的能引起中枢神经系统疾病的病毒和细菌分别是蜱传脑炎病毒和肺炎链球菌，后者主要存在于呼吸系统。检出率较高的病原蜱传脑炎病毒和脑膜炎奈瑟菌尚未包括在脑脊液样本检测试剂盒中，提示使用试剂盒进行感染性脑膜炎患者的病原诊断时要加强脑炎病毒和脑膜炎奈瑟菌的筛查。
　　研究结论：
　　本研究优化了人冠状病毒细胞培养和呼吸道来源样本的高通量测序方法。细胞培养样本：核酸提取后进行DNase处理去除宿主核酸，然后直接测序的方式获得的病毒全基因组序列质量最佳。呼吸道样本：核酸提取前DNase和RNase处理，核酸提取后DNase处理去除宿主核酸，SISPA扩增，然后测序，获得的病毒基因组覆盖率最高。病毒载量较高时，提高测序数据量可有效提高其基因组覆盖率；病毒载量较低时，提高数据量对提高基因组覆盖率无显著效果。SISPA的扩增准确性较好，灵敏度差。本实验中的两条HCoV-NL63序列属于C型。高通量测序结果提示，感染性脑膜炎患者的脑脊液样本中检出率最高的病毒和细菌分别是蜱传脑炎病毒和肺炎链球菌。