1.研究背景和目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,能促进间充质组织的再生。BMSCs在骨髓中含量极低,而组织工程需要大量的种子细胞,从动物骨髓分离BMSCs的难度在很大程度上限制了许多实验的开展。因此,建立一种持续、稳定、可多向分化的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系对细胞的体内、体外实验及组织工程至关重要。本实验拟通过分离、培养、纯化SD大鼠BMSCs,诱导其向成脂细胞、成骨细胞分化,并对其细胞表面标志物进行初步鉴定,希望建立一种理想的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养扩增体系,为组织工程寻找良好的种子细胞提供实践基础。2.材料和方法2.1 BMSCs的分离、培养：取6-8周龄SD大鼠10只,清洁级,大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉,75%酒精浸泡10分钟。无菌条件下取下胫骨及股骨,PBS液洗3次。剪去胫骨和股骨的干骺端,暴露骨髓腔,用无菌PBS液反复冲洗骨髓腔；将冲出的骨髓制成单细胞悬液,1200rpm离心5分钟,弃去上清,重悬,以3-4× 105个细胞/cm2接种于25cm2的培养瓶中,然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养。2.2 BMSCs的培养、纯化及传代：原代培养过程中,48-72小时全量更换培养液,以后每隔2-3天更换培养液。待细胞铺满瓶底至细胞融合成单层,长至80%-90%密度融合时,用0.25%胰酶消化,按照1：2进行传代培养。2.3 BMSCs形态学观察：倒置相差显微镜每日观察细胞形态变化及生长状况,拍照记录。2.4 BMSCs的鉴定2.4.1 BMSCs的定向诱导分化：选择P3代BMSCs,于6孔细胞培养板上接种BMSCs(5×103个细胞/cm2),待细胞贴壁生长至密度达80%时,加入成骨或成脂细胞诱导液,每2-3天换液1次,以未加诱导液的细胞培养孔作为对照。分别在诱导的第21天和第14天,对诱导分化的成骨细胞及脂肪细胞分别行茜素红和油红O染色。2.4.2流式细胞仪检测细胞表面标志物：收获生长状态良好的P3代细胞,0.25%胰酶消化,1200rpm离心5分钟,PBS液洗涤细胞2次,重悬,计数细胞,各管分别加入CD29、CD90、CD34单克隆抗体,同时每管样品设立同型阴性对照。室温避光孵育30分钟,PBS液洗涤去除未结合抗体,再用PBS液重悬细胞,流式细胞仪进行检测。3.研究结果3.1 BMSCs形态学观察骨髓细胞接种于培养瓶后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中。24小时后部分细胞开始贴壁生长,呈圆形、梭形或多角形。通过换液去除未贴壁的杂质细胞。48-72小时后可见放射状排列的细胞集落,梭形细胞为主。3-5天后细胞呈集落生长,融合80%-90%。12-14天细胞排列紧密,逐渐融合成片。消化传代后,传代细胞24小时完全贴壁生长。细胞呈梭形生长,生长旺盛。4-5天传代1次,可稳定连续传代10代以上,细胞形态及生长速度无明显变化。3.2 BMSCs成骨诱导分化鉴定大鼠P3代BMSCs经成骨诱导剂诱导第21天行茜素红染色,可见红染的钙结节,结节中心透光度较差,四周轮廓模糊,呈淡红色的晕轮区。3.3 BMSCs成脂诱导分化鉴定大鼠P3代BMSCs经成脂诱导剂诱导第14天,细胞内脂滴大量形成、合并呈串珠状。油红O染色为阳性,细胞内脂滴呈橘红色。3.4流式细胞仪检测结果培养的P3代大鼠BMSCs均一表达CD29,CD90,阳性率分别为93.160%，86.94%；而CD34呈阴性表达,阳性率分别为1.65%和1.57%。4.结论本研究采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离的大鼠BMSCs在形态学与生长动力学上均符合骨髓间充质干细胞的特征。在成骨、成脂诱导培养条件下,分别出现成骨、成脂表型特征,说明其可向这两种细胞分化,并通过细胞表达一些特异性表面抗原,证实了本研究分离培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的特异性,获得了数量足、纯度高、增殖能力强且生物学特征稳定的BMSCs,为组织工程提供充足的种子细胞打下坚实的基础。第二部分博莱霉素致大鼠肺纤维化模型的建立方法及比较1.研究背景和目的肺纤维化(PF)的病理特点为肺部炎症导致肺泡反复、持续性损伤及细胞外基质反复破坏、修复和过度沉积。该病预后极差、严重影响患者生存质量,病程一般呈进行性发展,最终引起呼吸功能衰竭而死亡。近年来,PF的发病率呈上升趋势。由于该病发病机制尚不清楚,临床上缺乏有效的治疗方法,病死率较高,因此建立可靠而稳定的PF动物模型是探索其发病机制和开发有效治疗药物的重要保障。目前用于复制PF模型所采用的动物主要是啮齿类动物。常用的PF诱导剂主要包括博莱霉素(BLM)。用BLM制作的肺纤维化模型,其生理学改变和病理组织学变化与人类PF近似,因此成为复制PF模型的常用药物。目前,采用不同方式、不同动物经多种途径给药建立的PF模型逐渐增多,均可成功建立PF模型。但是,不同给药方法所致模型的病理改变与人的病理变化及病变部位却不很相符,如何改进方法促使模型病变部位接近人类是亟待解决的重要问题。本研究拟选用BLM作为诱导剂,分别经腹腔、气管给药诱导大鼠发生PF,动态观察两种大鼠PF模型肺组织形态学与羟脯氨酸含量等的变化,以探讨一种更近似于人类PF病程的动物模型建立方法。2.材料和方法健康雄性SD大鼠80只,分别经气管、腹腔给予BLM诱导大鼠肺纤维化。随机分为①气管给药模型组(model A):一次性气管内注入博莱霉素(5mg/kg),分别于给药后第7、14、21天活杀10只,为model A7、modelA14、model A21组；②气管给药对照组(control A):大鼠在相同条件下经气管注入等量生理盐水,余同model A组,于第21天活杀10只；③腹腔给药模型组(]model B):大鼠每日左下腹腔注射博莱霉素(15mg/kg),连续5天。分别于给药后第7、14、21天活杀10只,为model B7、model B14、model B21组；④腹腔给药对照组(control B):每日腹腔内给予等量生理盐水,余同model B组,于第21天活杀10只。实验期间,每天观察各组动物的行为状态并记录体重变化。实验结束时取下双侧肺组织,测定肺组织湿干重比(W/D)；HE染色进行肺组织病理学观察及测定肺损伤定量评价指标(IQA),CMIAS-B真彩色病理图像分析系统在400倍下测定胸膜及肺泡间隔厚度；碱水法测定肺组织羟脯氨酸(HYP)含量；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肺泡灌洗液TNF-α、IL-6的含量；免疫组化检测转化生长因子-β(TGF-p)蛋白的表达水平。3.研究结果3.1各组大鼠起始体重并无差别。给予博莱霉素后,大鼠的体重值均有降低(P均<0.01)。3.2与对照组相比,给药大鼠W/D、IQA值均有升高(P均<0.01)；腹腔给药组与气管给药组相同时相点比较,W/D、IQA值明显降低(P<0.05或P<0.01)。3.3肺组织羟脯氨酸(HYP)含量变化：两种大鼠模型HYP含量均自第7、14天开始升高,第21天达高峰,腹腔给药组大鼠HYP含量明显高于气管给药组(P<0.01)。3.4肺泡灌洗液检测结果：与对照组相比,各给药组大鼠肺泡灌洗液中TNF-a与IL-6的含量均明显增加(P<0.05或P<0.01),且随时间的延长含量也逐渐增多。与气管给药组相同时相点比较,腹腔给药组肺组织TNF-a与IL-6的含量明显上调(P<0.05或P<0.01)。3.5免疫组织化学结果：与对照组相比,给药组大鼠肺小静脉TGF-β的含量均明显增加(P<0.01),且随时间的延长TGF-β的含量也逐渐增多(P<0.01),至给药后第21天达高峰。与气管给药组相同时相点比较,腹腔给药组肺小静脉TGF-β蛋白表达明显增强(P<0.05),阳性细胞主要分布于肺泡上皮细胞及肺血管内皮细胞。3.6肺组织切片HE染色光镜下观察发现,对照组大鼠肺泡壁完整,肺泡间隔未增厚；BLM处理组第7天可见大量炎症细胞浸润,组织水肿；第14天肺泡间隔增宽,结构紊乱,出现纤维化病灶；第21天肺泡结构破坏严重,细胞外基质大量沉积,形成广泛纤维化。气管给药组大鼠肺泡壁厚度较腹腔给药组大鼠增厚明显(P<0.05)；腹腔给药组大鼠胸膜较气管给药组明显增厚(P<0.01)。3.7肺组织切片电镜下肺组织超微结构显示,BLM处理组肺微小动脉,微小静脉及毛细血管的内皮和基底膜有不同程度的损害；肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞均有不同程度的损伤。3.8肺组织HYP与W/D、IQA之间存在显著的正相关关系(r分别为0.418,0.849,P均<0.01)；HYP与TNF-α、IL-6和TGF-β蛋白之间亦存在非常显著的正相关关系(r分别为0.833,0.882,0.861,P均<0.01)。4.结论4.1本研究分别通过气管和腹腔给予BLM,可致大鼠肺组织结构破坏,呈现典型的肺纤维化病变,两种给药方法均可成功制备博莱霉素致大鼠PF动物模型。4.2 BLM诱导大鼠肺纤维化过程中,可能通过促进肺组织中TNF-α、IL-6和TGF-β的产生,引起炎症介质对支气管肺泡上皮及血管内皮细胞的损伤和异常修复,破坏肺泡-毛细血管膜的完整性,刺激成纤维细胞异常增殖和胶原合成增加,从而促进肺部炎症反应和肺纤维化的发病。4.3腹腔给药具有操作快捷、简便、死亡率低、个体间差异小等优点,可以降低因手术操作熟练程度不同而造成动物纤维化程度的差异；且腹腔给药引起胶原代谢紊乱程度重、形成的病变主要位于胸膜下,与人类IPF的影像学表现接近。腹腔内给药诱导动物发生PF可能是较为理想的模型制作方法。第三部分 骨髓间充质干细胞对博莱霉素致大鼠肺纤维化干预效应的研究1.研究背景和目的特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明、以普通型间质性肺炎(UIP)为特征性病理改变的一种慢性、进行性肺间质疾病。该病进行性加重,最终导致呼吸功能不全而死亡。临床上除肺移植外尚无其它有效治疗方法。但由于诸多因素限制,许多患者不能或不适合接受肺移植术,故此方法实际难以在临床上得到广泛开展。因此,探索一种能在临床具有实用前景的IPF治疗方法具有重要意义。越来越多的研究表明氧化应激与IPF的形成和发展有着密切关系。当肺内产生过多的ROS时就会导致氧化应激,继而引起不同程度的肺损伤。肺脏作为体内最重要的器官之一,由于其独特的解剖结构和外界相通的特性,决定了肺是体内最易受到氧化应激攻击的靶器官。因此,研究氧化应激致IPF的作用机制对于IPF的预防和治疗具有重要意义。机体内氧化还原水平失衡是众多疾病的病理生理基础。Nrf2作为细胞抗氧化应激反应的核心转录因子,能够激活机体内源性抗氧化应答,保护细胞抵抗各种内源性应激和环境应激。Nrf2如果出现功能障碍,可加重氧化应激源的毒性,导致细胞出现各种功能障碍甚至死亡。大量的研究证实Nrf2-ARE信号通路及其下游基因在抗动脉粥样硬化、抗炎、抗肿瘤、抗凋亡和神经保护等方面发挥重要的保护功能。由此,我们提出如下假说：第一,Nrf2-ARE通路在保护肺组织细胞抵抗氧化损伤中发挥重要作用；第二,IPF患者肺组织细胞中Nrf2-ARE通路可能存在异常,导致其对氧化应激更为敏感。由于干细胞可能具有修复组织损伤的潜力,故而近年来干细胞疗法成为PF治疗中的一个热门研究课题。本研究拟腹腔内少量多次注射BLM制备PF动物模型,通过尾静脉输注BMSCs,使其定植于受损肺组织,分别从动物、器官、细胞及分子水平观察BMSCs对PF的治疗作用及其可能机制,为临床防治IPF提供实验理论依据。2.材料和方法体外分离、培养SD大鼠BMSCs,传至第四代用于实验。40只SD大鼠随机分为4组：阴性对照组(Control组)、肺纤维化组(BLM组)、间充质干细胞治疗组(BLM+BMSC组)和间充质干细胞对照组(BMSC组),每组各10只大鼠。BLM组每日左下腹腔内注射博莱霉素(15mg/kg),连续5天,制备肺纤维化模型；BMSC+BLM组于博来霉素注射后立即经尾静脉注入大鼠BMSCs悬液(2×106/1.5m1),连续5天；BMSC组经腹腔注入等量生理盐水,余同BMSC+BLM组；Control组作为阴性对照,经腹腔注入等量生理盐水后,未给予其他处理。各组大鼠分别于造模后第21天处死。取肺组织检测肺湿干重量比(W/D)；分别用HE染色和MASSON染色进行肺组织病理学观察；碱水法测定肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量；分别用硫代巴比妥酸(TBA)法、黄嘌呤氧化酶法检测血浆丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力；Western-blot检测肺组织中Nrf2、NQO1、HO-1、y-GCS蛋白的表达。3.研究结果3.1与Control组比较,BLM组和BLM+BMSC组W/D值和HYP含量明显升高,有显著性差异(P<0.01)；与BLM组大鼠比较,BLM+BMSC组W/D值与HYP含量明显降低(P<0.01)。3.2 HE和MASSON染色显示BMSCs显著降低大鼠肺泡炎和肺纤维化的程度。3.3生化指标检测显示：与Control组相比,BLM组大鼠血浆SOD活性显著降低(P<0.01),MDA含量显著增高(P<0.01)；与BLM组相比,间充质干细胞治疗组大鼠血浆SOD活性明显上调,MDA含量显著降低(P<0.01)。3.4 Western-blot结果显示：与Control组比较,BLM组大鼠肺组织Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白表达水平均明显升高(P均<0.01)；与BLM组比较,BLM+BMSC组大鼠肺组织中Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS蛋白的表达水平进一步上调(P<0.05或P<0.01)。3.5相关性分析结果显示：Nrf2蛋白和NQO1、HO-1、γ-GCS蛋白存在显著的正相关关系(r分别为0.847,0.924,0.957,P均<0.01)。4.结论4.1 BLM诱导的大鼠肺纤维化模型中,氧化应激反应增强,激活了机体内源性抗氧化信号通路Nrf2-ARE。肺纤维化大鼠肺脏存在明显的氧化应激损伤和抗氧化应激反应。激活的Nrf2-ARE通路及下游Ⅱ相解毒酶HO-1、y-GCS和NQO1的表达,发挥了内源性抗氧化应激和解毒的功效。但是,这种代偿保护作用非常有限,并不能彻底改变肺纤维化病程中氧化应激状态的存在。4.2 BMSCs的移植可显著提高肺纤维化大鼠Nrf2的含量,进而促进下游保护性蛋白HO-1、γ-GCS和NQO1的表达,清除ROS,抑制肺组织氧化应激反应,由此减轻损伤肺组织中成纤维细胞的增生,对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化具有积极的保护作用。