血吸虫病分布广泛,危害严重,为人畜共患的重大疾病之一。雌雄虫合抱是血吸虫雌虫发育成熟和产卵的关键,成熟雌虫所产生大量虫卵而引起肝脏病变是造成宿主主要病理损害和疾病再传播的前提。本论文针对此特点开展了日本血吸虫性别差异蛋白质组和雄虫特异性表达的抱雌沟蛋白基因的功能研究,以探索血吸虫雌雄虫合抱、发育成熟的分子机理,开拓免疫预防新途径。 一、关于日本血吸虫性别差异蛋白质组研究。本研究利用蛋白质组学技术首次对日本血吸虫虫卵、童虫(14天)、成熟雌虫和成熟雄虫的可溶性蛋白、疏水性蛋白和膜蛋白进行了系统分离,构建了各自的高分辨率双向电泳图谱。表明虫卵、童虫、成熟雌虫和成熟雄虫在可溶性蛋白组份分别分离到1016±67,1808±89,1142±45和1288±32个蛋白斑点;在疏水性蛋白组份分别分离到1425±108,952±59,847±75和965±69个蛋白斑点;在膜蛋白组份分别分离到78±3、67±3、108±4和122±4个蛋白斑点。比较分析获得合抱后雌雄成虫特异呈现的性别差异蛋白质谱,雌雄成虫分别独特呈现23±2和41±4个可溶性蛋白斑点;26±3和11±1个疏水性蛋白斑点;4和5个膜蛋白斑点。鉴定了28个合抱后雌雄成虫特异呈现的蛋白。结果提示参与细胞间信息传递的信号分子、参与基因转录和蛋白翻译调控分子和参与代谢酶类、发育调节因子等在合抱后雌雄虫呈现表达差异。本研究为深入揭示雌雄虫合抱后虫体的发育、雌虫成熟产卵的机制提供了分子基础,对开发新的疫苗候选抗原和药物靶标具有重要价值。 二、关于日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的功能研究。抱雌沟蛋白为血吸虫雄虫特异性表达,在与其合抱的雌虫体表广泛分布一种性别特异性蛋白。本论文利用RNA干扰技术对抱雌沟蛋白基因的功能进行了研究。根据日本血吸虫抱雌沟蛋白基因序列设计3对dsRNA分子(s1,s2,s3)并分别按低和高浓度(50nM利200nM)加入培养体系以干扰抱雌沟蛋白基因的表达。利用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光分析证明能显著抑制抱雌沟蛋白基因的转录,可高达84%。又分析了dsRNA分子干扰的剂量效应,结果表明dsRNA分子(s1)抑制抱雌沟蛋白基因具有剂量依赖性,当dsRNA分子终浓度为100nM作用7天时,抱雌沟蛋白基因的转录水平降低75%。对虫体雌雄虫合抱效应的观察表明,干扰后雌雄合抱受到不同程度的影响,其中两个高浓度干扰组(s1,s2)的合抱现象完全受到抑制。利用扫描电子显微镜分析合抱完全受到抑制的雄虫抱雌沟表膜结构,与对照组相比其结构呈现瘠的间断,瘠间隙大和刺短的变化。进一步利用cDNA微阵列对干扰抱雌沟蛋白基因后引起的虫体相关基因表达变化进行了初步探索,结果显示参与信号转导利转录调控因子功能的基因呈现表达下调,参与膜转运、能量和离子代谢及应激蛋白等基因呈现表达上调。通过上述研究发现抱雌沟蛋白基因具有影响血吸虫雌雄虫合抱功能,本论文结果也是国内外首次明确某种物质能影响雌雄虫的合抱,对于开拓抗血吸虫生殖发育新途径的理论基础和实践应用具有重要意义。 本研究还采用尾静脉动态注射技术将dsRNA分子导入到血吸虫感染的小鼠体内。结果表明