动物转基因是目前生物领域的研究热点之一，其基本特征是改变了动物的遗传组成，使动物按照人们的意愿进行改造。以传统的原核显微注射法生产转基因动物的效率非常低下(成功率仅为3～5％)，严重地制约了转基因动物研究进展。与之相比，体细胞克隆技术在生产转基因动物方面有着不可比拟的优越性。利用体细胞克隆技术生产转基因动物的优点是：转基因操作主要是集中在细胞水平上完成，从而极大地提高了生产效率、降低了生产成本和减少了工作强度；在体外可以监控转基因的表达水平，以便获得高效表达转基因动物；对基因进行定点修饰，促进生物医药、功能基因组等方面的研究。本实验以Myostatin基因为靶基因、含有新霉素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、胸苷激酶、LoxP位点的双标记选择载体作为框架结构、羊胎儿成纤维细胞和成年耳部成纤维细胞系为转染细胞，测定了不同转染方法(磷酸钙法、脂质体法及电击法)的转染效果，筛选阳性细胞克隆，借助体细胞克隆技术生产转基因克隆胚胎。建立了一套完整的转基因结构制备、体细胞的传代培养、体细胞性别鉴定、转基因、转基因细胞系建立、转基因克隆胚胎的生产等操作程序，为羊转基因体细胞克隆提供了行之有效的实验方法。 1、从7个25～35天胎儿中分离出成纤维细胞，经传代培养建立7个细胞系，并对7个细胞系进行了PCR性别鉴定，4个为雌性，3个为雄性。对3个细胞系的染色体(传20代)倍性分析表明，3个细胞系的染色体倍性在培养过程中没有发生明显的变化，染色体倍性正常率在75％～84.44％，建立起了良好的体细胞体外培养体系。 2、根据以发表的绵羊、猪、小鼠和牛Myostatin基因的序列同源性设计了2对含有特异酶切位点的引物，率先克隆了山羊、绵羊Myostatin基因内含子Ⅰ和Ⅱ的全部序列，并输入到国际Genbank数据库(山羊内含子Ⅰ和Ⅱ的序列号分别为AF393639，AY032689；绵羊内含子Ⅰ和Ⅱ的序列号分别为AF393618，AF266758)。 3、利用长片段PCR技术扩增了从外显子Ⅰ到外显子Ⅲ的4.5Kb片段作为5‘同源臂，外显子Ⅲ到3’侧翼区1.4kb的3‘同源臂，经序列测定后与框架在连接形成完整的同源重组转基因结构(简称ploxP-M质粒)。在两同源臂之间缺失了571bp的DNA序列和119个氨基酸结构，造成Myostatin基因移码突变而失去活性，使转基因动物出现双肌现象。 4、用线性化的GFP质粒，采用不同的方法(磷酸钙法、脂质体法及电击法)转染山羊胎儿成纤维细胞，摸索与优化实验条件。结果表明：①、磷酸钙法：DNA浓度为2μg，转染时间6～8h；②、脂质体法：8μL脂质体和2 μg DNA混合转染8h；③、电击法：2μg、电脉冲时间为15ms方波脉冲1次和60V/mm的场强时转染效率较高。 5、经过筛选药物的细胞毒性检测，确定800IU/ml为G418的使用剂量，经过1周博土学位论文 利用体细胞核移植技术主产转基因山羊的研究 2002．11的时间可将非转染细胞全部杀死；用 200V glhL GANC筛选 1周杀死非同源重组的随机整合细胞。实验共分离了 180个阳性细胞克隆，但只有 sl个克隆可以进一步增殖扩大。对40个克隆点细胞进行PCR鉴定，证明40个克隆点的细胞均为阳性。其中一个克隆株为纯合子，其纯合子比率为1／40。 6、以荧光蛋白为报道基因，观察到不同细胞系的表达情况是有差异的。主要原因是：l、在转染时细胞所处的细胞周期不同，细胞核整合外源DNA的拷贝数不同；2、外源DNA在细胞核中整合的位置不同，产生位置效应。因此产生了基因表达上的差异。 7、在体外培养条件下，利用成熟的山羊卵母细胞和非转基因的胎儿成纤锥细胞进行了核移植条件测定。在电场强度为 2．ZK Vlcm，重组胚的融合率为 69W78％。在电场强度为 2．ZK V／cm的条件下，融合胚的卵裂率为 66 W66．99o，8—16cell胚胎率为 55W57．33％。 8、转基因细胞系克隆后绿色荧光表达的结果与讨论 通过实验证明，构建的plOXP－M双标记同源重组转基因载体可以很好地实现基因敲除目的。磷酸钙法、脂质体法及电击法可有效地转染山羊胎儿成纤维细胞，但以电击法效果为最佳，该转染方法还具有适合于不同片段大小、操作简便、成本低廉等优点。在随机整合细胞系中由于插入位点和转基因拷贝数的不同造成了荧光蛋白表达水平的差异，但更重要的是不同的转基因细胞系在克隆后所形成的体细胞克隆胚胎中表达水平差异很大，主要是由于基因的印迹不同所造成，这也是转基因克隆在体外能够检测转基因表达的非常重要优点，经过克隆胚胎移植后己有部份个体妊娠。