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糖尿病肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一,常发展至终末期肾脏病,且与慢性肾脏病患者的死亡率密切相关。尽管通过强化降血糖、降血脂、降低尿蛋白以及降压治疗,可延缓DKD进展至终末期肾脏病的速度,但仍不能有效阻断其进展至终末期肾脏病,因此尚需要深入探讨其发生及进展机制,以寻求临床治疗靶点。糖尿病是代谢性疾病,存在多种代谢紊乱,肾脏作为体内静息代谢率最高的器官之一,是糖尿病微血管并发症的高风险器官。所以,研究糖尿病疾病状态下肾脏代谢改变对于攻克DKD意义重大。目前针对DKD发生发展过程中肾脏代谢改变的研究成果仍存在争议,部分研究表明DKD时肾脏发生(Fatty acid oxidation,FAO)减少,糖酵解增加的能量代谢重编,而新近代谢组学研究发现DKD时FAO及糖酵解通量均是增加的。目前针对DKD肾脏细胞代谢改变的研究主要基于肾脏皮质的组学数据。事实上,肾脏皮质包含多种细胞类型,且不同部位的细胞根据自身能量需求的不同,存在不同的能量偏好。在应对DKD代谢应激的时候,不同类型的肾脏细胞发生了怎样的代谢改变,在肾脏皮质整体水平上的研究显然是不够的。借助单细胞测序技术,获得整个肾组织中不同细胞类型的代谢信息无疑对DKD发病机制的研究有着重要意义。考虑到仅局限于转录组水平的研究,与细胞内真实的代谢改变可能存在不同,进一步进行相关靶向代谢组研究亦十分重要。近年来,“DKD肾小管损伤为中心”观点被提出和证实,且肾小管上皮细胞能量代谢非常活跃,线粒体含量高,生理情况下高度依赖FAO产生ATP,所以脂代谢改变在肾小管细胞能量代谢重编中起着重要作用,此外其代谢灵活性差,理论上对糖尿病代谢紊乱造成的损伤更为敏感。肾小管上皮细胞脂代谢紊乱可引起肾脏脂质蓄积,进而引起细胞损伤。糖尿病时肾小管上皮细胞脂代谢改变伴随大量线粒体活性氧。Mt ROS能够通过影响基因稳定、代谢后修饰等多种方式改变代谢酶参与细胞代谢途径的调控。更加深入地理解肾小管上皮细胞脂代谢改变和Mt ROS的之间的相关机制至关重要。本课题,重点关注了Mt ROS在肾小管上皮细胞脂代谢改变中的可能作用。目的:(1)基于db/db小鼠肾脏单细胞转录组数据,绘制DKD肾脏细胞代谢图谱,探索DKD时肾脏不同细胞代谢改变;(2)利用非靶向代谢组学对db/db小鼠肾皮质代谢物进行量化,识别差异代谢物,分析其生物学意义,以揭示DKD时肾皮质代谢机制;(3)利用自发糖尿病模型db/db小鼠及体外培养的高糖诱导的人肾小管上皮细胞(Human proximal tubular epithelial cells,HK-2)系,探讨Mt ROS在肾脏脂代谢重编及肾小管损伤中的作用。方法:(1)从GEO数据库中获取db/db小鼠肾脏单细胞转录组原始数据,进行数据过滤及标准化,对特定细胞类型进行亚聚类及注释,进而进行细胞差异基因分析、KEGG富集及细胞间通讯分析;(2)以db/db小鼠为研究对象,采集肾皮质标本,使用液相色谱-质谱法对各组小鼠顺皮质代谢物进行量化,并进行多元统计分析识别差异代谢产物,并进一步对差异代谢产物进行KEGG富集分析;(3)使用线粒体靶向ROS清除剂SS31干预8周龄的自发糖尿病db/db小鼠及体外培养的高糖刺激的HK-2细胞系,使用比色法、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、Western blot、电镜、流式细胞术等方法检测肾脏功能指标、尿白蛋白、肾小管损伤指标、肾组织病理学、脂滴蓄积情况、FAO相关酶(PPARα、CPT1a、ACOX1)、线粒体形态、线粒体膜电位、细胞ATP含量、细胞Mt ROS水平、线粒体生物发生指标(PGC-1α、p-AMPK)等,探讨Mt ROS在肾脏脂代谢重编及肾小管损伤中的作用。结果:(1)在各种肾脏细胞中,近端肾小管上皮细胞代谢通路的总体活性更高,更具有可塑性,糖代谢及脂代谢改变尤为显著,且近端肾小管上皮细胞与DKD免疫微环境调控密切相关,近端肾小管上皮细胞代谢改变可能是DKD时代谢重编程的主要原因;(2)DKD肾皮质时存在代谢改变,代谢物改变涉及三羧酸循环、氧化磷酸化、亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢、胆固醇代谢、胰高血糖素信号通路、胰岛素抵抗、碳代谢、醚脂类代谢、色氨酸代谢、嘌呤代谢、类固醇生物合成等;其中乙酰左旋肉碱及亚麻酸下降,甘油磷脂、溶血磷脂酰胆碱水平上升,提示DKD时可能存在脂代谢重编及肾小管间质损伤;三羧酸循环代谢产物柠檬酸下降,琥珀酸增加,而富马酸无明显变化,提示DKD时存在线粒体功能障碍,具体机制仍需进一步研究;(3)Mt ROS介导糖尿病小鼠肾小管间质损伤及高糖诱导的HK-2细胞损伤,给予SS31清除Mt ROS可改善糖尿病小鼠肾小管间质损伤及高糖诱导的HK-2细胞损伤;Mt ROS促进糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍及脂质沉积,给予SS31清除Mt ROS可改善糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍及脂质沉积;改善高糖诱导的HK-2细胞FAO障碍,可改善高糖诱导的HK-2细胞脂质沉积及细胞损伤;Mt ROS促进糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2线粒体损伤,给予SS31清除Mt ROS可改善糖尿病小鼠肾皮质及高糖诱导的HK-2细胞线粒体损伤。结论:(1)DKD时存在能量代谢重编,近端肾小管上皮细胞代谢改变可能是DKD时代谢重编程的主要原因;(2)DKD时存在脂代谢重编、肾小管间质损伤及线粒体功能障碍;(3)Mt ROS促进DKD时肾小管上皮细胞脂质沉积、细胞损伤及线粒体损伤;(4)Mt ROS可通过影响FAO促进糖尿病肾小管损伤。