Irx5基因是伊洛魁同源盒基因家族（Iroquois homeobox gene family）中一员。该家族的编码蛋白均具有一个高度保守的同源结构域,含有63个氨基酸,可与DNA特异结合,具有转录因子活性。有报道表明Irx家族的一些成员与肿瘤的发生有着一定的关联,其中Irx1是一个潜在的胃癌肿瘤标志物,Irx1的表达能够抑制胃癌细胞生长,入侵和肿瘤形成;Irx2在骨肉瘤中能够促进细胞的增殖和入侵;Irx3在前列腺癌细胞系LNCaP中表达下调;Irx4可以通过与维生素D受体相互作用抑制前列腺癌的生长;Irx5敲除会导致前列腺癌细胞系LNCaP细胞数的减少,增加细胞凋亡。此外,Irx5基因在高转移乳腺癌细胞系中低表达,在低转移乳腺癌细胞系中高表达,且其表达水平与患者癌细胞转移能力呈明显负相关。本实验室通过构建Irx5基因过表达的MDA-MB-231细胞,证实了Irx5基因能够抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖、迁移和入侵。为了进一步研究Irx5基因对乳腺癌细胞的影响,我们利用RNAi技术,构建了三株Irx5基因沉默MCF7乳腺癌细胞株,并利用其中沉默效果最好的一株细胞MCF7-shRNA2与MCF7-对照进行细胞增殖、迁移和入侵等实验,证实Irx5基因沉默可促进乳腺癌细胞MCF7的转移和入侵。研究结果如下:1.根据人Irx5基因（NM₀05853）序列设计合成出三对shRNA片段,利用T4连接酶将其分别与Bam H（40）和EcoR（40）酶切线性化慢病毒载体连接,转化感受态细胞,获得了三组慢病毒干扰质粒,分别是shRNA1干扰慢病毒质粒（miRZip-shRNA1）、shRNA2干扰慢病毒质粒（mi RZip-shRNA2）和shRNA3干扰慢病毒质粒（miRZip-shRNA3）。将构建的shRNA干扰慢病毒质粒和包装质粒MIX共感染HEK293T细胞,经过慢病毒包装,浓缩以及滴度测定等步骤获得最终的shRNA干扰慢病毒原液。2.利用shRNA1干扰慢病毒、shRNA2干扰慢病毒和shRNA3干扰慢病毒分别感染MCF7细胞,经嘌呤霉素筛选,获得了三组Irx5基因沉默乳腺癌细胞株,分别是MCF7-shRNA1,MCF7-shRNA2,MCF7-shRNA3以及用空载体慢病毒感染的细胞株MCF7-对照。Western blotting检测和qPCR检测结果显示,在MCF7-shRNA1,MCF7-shRNA2,MCF7-shRNA3三组乳腺癌细胞中,Irx5基因都有一定的沉默效果,其中MCF7-shRNA2沉默效果最好,达到49%。3.将MCF7-shRNA2细胞和MCF7-对照用于功能分析实验:MTT法检测细胞增殖实验结果表明,MCF7-shRNA2与MCF7-对照两者差异不大,说明Irx5基因沉默对MCF7乳腺癌细胞的增殖能力没有明显的影响效果;细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验结果表明,MCF7-shRNA2转移能力明显比MCF7-对照强,说明Irx5基因沉默能够促进MCF7乳腺癌细胞转移;Transwell侵袭实验结果表明,MCF7-shRNA2侵袭能力明显比MCF7-对照强,说明Irx5基因沉默能够促进MCF7乳腺癌细胞入侵。本研究进一步证实了Irx5基因对乳腺癌细胞转移能力的抑制作用,不仅为深入了解乳腺癌的发生发展及转移和入侵机制提供一定的理论依据,而且为转移性乳腺癌的分子诊断和靶向治疗奠定坚实的理论基础。