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胃癌是最常见的恶性肿瘤,化疗是主要治疗方法之一,但是在反复接触某种药物后,肿瘤细胞可以获得对该药物以及其他结构和作用机制不尽相同的多种药物的耐受性,即多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)。肿瘤细胞对药物的抗性是目前治疗最棘手的问题。进一步研究肿瘤细胞抗药性的分子基础,已成为提高肿瘤治疗和预后的热点问题。 本研究所建立了4株耐药胃癌细胞亚系,研究显示只有长春新碱诱导的胃癌耐药细胞SGC7901/VCR是由MDR1/Pgp介导的经典MDR,染色体G带分析显示其6号染色体结构改变。先前通过消减杂交研究SGC7901及其耐药细胞亚系,我们发现位于6p21.3的转录相关锌带蛋白基因ZNRD1仅在SGC7901/VCR中高表达。本研究将进一步证实ZNRD1在胃癌耐药细胞中的差异表达,并深入探讨ZNRD1的功能及其可能的作用机制,以期为逆转胃癌细胞多药耐药的研究奠定基础。 目的:克隆ZNRD1的编码基因,鉴定其在胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中的差异表达,探讨其功能及可能的作用机制。 第四军医大学博士学位论文一 方法:()应用 Northern blot和半定量RTPCR检测锌带基因 ZN’RDI在胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/VCR中RNA水平的差异表达;(2)应用RTPCR从高表达ZNRDI 的SGC7901/VCR细胞克隆ZNRD编码 CDNA;(3)将 ZNRD基因的 CDNA片段克隆入原核表达载体,在大肠杆菌体内进行表达;(4)利用Ni-NTA柠纯化原核表达产物,并以纯化的表达产物免疫新西兰兔制备多克隆抗体;K)用 Westernblot鉴定制备的抗血沽;(6)通过免疫细胞化学方法检测ZNMil基因在胃癌细胞和长春新碱耐药细胞蛋白水平的差异表达;门)采用分子克隆技术,构建反义核酸,将 ZNRD基因全长 CDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pCDNA3.1 的多克隆位点之间,用脂质体介导法转染SGC7901 /V/VCR细胞,,乏印迹方法检测ZNRDI在转染细胞及其对照细胞中的表达;(8)通过流式细胞仪分析转染细胞及对照细胞的细胞周期变化;(9)MTT实验绘制细胞生长曲线,进行体外药物敏感性分析,计算细胞三药物的 IC50值禾耐药乡数(TCSIStapC* ifldCX,RI);( 0)构建正义表达载体,经显微注射导入SGC7901细胞,点印迹方法检测ZNIOJI在转染细胞及其对照细胞中的表达;()MTT实验进行体外药物敏感性分析:门2)通过流式细胞仪分析反义核酸转染细胞及其对照细胞的阿霉素蓄积量;(1)Western hi。t检测细胞中耐药相关分子MDRI、MRP。GST。、MGrl的变化。 结果:()Northern blot和半定量 RTPCR结果进一步证实胃癌耐药细胞SGC7901/VCR与非耐药细胞SGC7901相比,ZNRDI基因的RNA水平处于高表达状态;(2)ZNRDI在大肠杆菌BLZI中诱导表达成功,表达量占细菌总蛋白量的32%,用纯化的ZNRDI蛋白成功制备了兔抗 -3. 第四军医大学博士学位论文人 ZNRD 多克隆抗体,Western blot鉴定制备的抗血清可特异识别ZN-RD 蛋白;臼)免疫细胞化学方法显示 ZNRD 定位于细胞核,在SGC79m/VCR细胞中的蛋白表达水平较SGC79m细胞明显增高;(4)点印迹结果证实,反义核酸转染SGC7901/VCR细胞后降低了ZNILDI的蛋白表达:(幻流式细胞仪检测结果表明,反义核酸转染细胞生长受到抑制;“)MTT实验显示,细胞生长数明显减少、这度减慢,反义核酸转染细胞不仅对建系时所用化疗药物**R的敏感性明显增强,而且增强了对阿霉素的敏感性:门)点印迹结果证实,正义表达载体转染S*0”1细胞,可增强ZN RDI蛋白的表达,转染细胞对**R的耐药性增强;(8)流式细胞仪检测结果表明,反义核酸转染细胞内阿霉素的蓄积增加;(9)Western blot检测反义核酸转染 SGC7901/VCR细胞中,Pgp和 MGrl表达量减少,转染 ZN-RDI的 SGC7901细胞 Pgp和 MGrl表达量增加,MRP和 GST。的表达量无明显变化。 结论:胃癌耐药细胞SGC7901/VCR与非耐药细胞SGC7901相比,ZN-RDI基因的 RNA和蛋白水平均处于高表达状态。反义核酸转染有效地降低了 ZNKD 蛋白的表达,可不同程度地使己产生耐药肿瘤细胞的MDR表型发生逆转,参与了胃癌细胞 MDR的形成。ZNRDI基因可能通过与 Pgp和 MGrl的作用而影响细胞的耐药表型。