雌激素在调节脊椎动物性别决定与分化及生殖活动中起着重要作用。雌激素通过雌激素受体发挥作用。在四足动物中,有两个不同的雌激素受体基因Esr1和Esr2,而在真骨鱼中,由于其特有的全基因组复制,有三个雌激素受体基因esr1,esr2a和esr2b。迄今为止,仅在人类和模式生物中,包括小鼠、大鼠、斑马鱼和青鳉,研究了雌激素受体的独特作用。在非模式生物中,雌激素/受体信号在生殖发育和配子发生中的生理作用仍有待阐明,在罗非鱼中,是哪个雌激素受体介导雌激素在性别决定和配子发生中起作用仍不清楚。本研究通过CRISPR/Cas9,在罗非鱼中建立了esr1纯合突变体,利用实验室已建立的esr2a和esr2b两种纯合突变体,分析了esrs的缺失对雌性和雄性罗非鱼生殖发育和配子发生的影响。主要研究结果如下:1.esr1纯合突变鱼的获得及其在性腺中的功能研究。通过CRISPR/Cas9成功突变esr1基因,靶位点位于第1个外显子上,选择位于靶位点上的限制性内切酶HypAV用于筛选F0代阳性鱼。将esr1 F0代阳性XY鱼与WT XX鱼交配,获得F1代杂合突变鱼。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）进行筛选,选择删除8 bp造成移码突变的杂合突变XX鱼和XY鱼交配获得F2代纯合突变鱼。对F2代的性腺表型分析显示,esr1^-/-XX与WT XX鱼在卵巢形态、GSI（Gonadal somatic index,性腺成熟指数）、育性、卵子发生、血清E2水平等均无明显差异,esr1-/-XY与WT XY鱼在精巢形态、GSI、育性、精子发生、血清11-KT水平、输精管面积、精子的形态和活力特性等均无明显差异。Real-time PCR结果显示,在esr1-/-XX鱼中esr2a的表达量上调,esr2b的表达量无明显变化,在esr1-/-XY鱼中esr2a和esr2b的表达量均无明显变化。2.esr2a在性腺中的功能研究。实验室前期已建立esr2a纯合突变体,由于时间关系,仅分析了esr2a-/-XX鱼在90 dah（Days after hatching,孵化后天数）的卵巢表型,发现在90 dah时,WT XX鱼卵巢中主要为I、II时相的卵母细胞,而esr2a-/-XX鱼卵巢充满卵原细胞和I时相的卵母细胞。本研究进一步分析了esr2a-/-XX鱼在180和360 dah及esr2a-/-XY鱼的性腺表型,发现在180 dah时,WT XX鱼卵巢中含有各时相的卵母细胞,而esr2a-/-XX鱼卵巢仅含有Ⅰ、Ⅱ时相及少量Ⅲ时相卵母细胞,卵巢较小且GSI明显低于WT XX鱼,表明其卵子发生延迟,但在360 dah时,esr2a-/-XX鱼卵巢含有各时相的卵母细胞,卵巢形态、育性及血清E2水平均与WT XX鱼无明显差异,表明其卵子发生得以恢复。WT XY鱼在90 dah时精巢中存在精原细胞、精母细胞和精细胞,在180dah时精巢中存在大量成熟精子,与WT XY鱼相比,在90和180 dah时,esr2a^-/-XY鱼精巢形态、GSI及血清11-KT水平等均无明显差异,但esr2a-/-XY鱼的精原细胞显著减少,输精管面积显著减小,且其育性显著减低。与此相一致的是,esr2a-/-XY鱼中存在大量异常形态精子,且精子的运动指标VCL（平均曲线运动）、VSL（平均直线运动）、BCF（平均鞭打频率）等均显著降低。Real-time PCR结果显示,在esr2a^-/-XX与esr2a^-/-XY鱼中esr1和esr2b的表达量均显著上调。3.esr2b在性腺中的功能研究。实验室前期已建立esr2b纯合突变体,由于时间关系,仅分析了esr2b-/-XX鱼在90 dah的卵巢表型,发现在90 dah时,与WT XX鱼一样,esr2b-/-XX鱼卵巢充满卵原细胞和Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞。本研究进一步分析了esr2b-/-XX鱼在180和360 dah及esr2b^-/-XY鱼的性腺表型,发现与WT XX鱼相似,在180和360dah时,esr2b-/-XX鱼卵巢含有各发育时期的卵母细胞,虽然其卵子发生与WT XX鱼无明显差异,但其由于卵巢无法与生殖孔相连,呈现截短的卵巢,表现出完全不育,且其血清E2水平显著高于WT XX鱼;在360 dah时,卵巢呈现退化现象,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）显示,PCNA（细胞增殖的marker）、Casepase3（细胞调亡的marker）、Cyp11b2（雄激素11-KT合成的关键酶）的阳性信号显著增多。WT XY鱼在90 dah时精巢中存在精原细胞、精母细胞和精细胞,在180 dah时精巢中存在大量成熟精子。与WT XY鱼相比,在90和180 dah时,esr2b^-/-XY鱼GSI、各级生精细胞的发育、输精管面积及血清11-KT水平等均无明显差异,但是esr2b-/-XY由于精巢无法与生殖孔相连,呈现截短的精巢,表现出完全不育,有趣的是,解剖取出其精巢收集精液,进行体外授精,其育性却与WT XY鱼无明显差异。与此相一致的是,esr2b-/-XY鱼中精子形态正常,且精子的运动指标VCL、VSL、BCF与WT XY鱼无明显差异。Real-time PCR结果显示,在esr2b^-/-XX鱼中esr1和esr2a的表达量显著下调,而在esr2b^-/-XY鱼中仅esr2a的表达量显著上调。4.esr2a^+/-esr2b^+/-XX鱼及PHTPP腹腔注射WT XX鱼的表型分析。利用实验室前期已建立的esr2a和esr2b纯合突变体,进一步建立了esr2a+/-esr2b+/-突变体,并检测分析其性腺表型。结果显示,在180 dah时,esr2a+/-esr2b+/-XX鱼卵巢中存在大量卵原细胞,仅仅存在极少量的Ⅱ时相和Ⅲ时相卵母细胞,IHC显示,Cyp19a1a的表达量显著低于WT XX鱼;而Cyp11b2和Gsdf的表达量显著高于WT XX鱼。由于esr2a^+/-esr2b^+/-XX鱼不育,建立esr2a-/-esr2b-/-突变体很困难。PHTPP是一种哺乳动物Esr2的拮抗剂,离体研究已证明,PHTPP能够有效抑制罗非鱼的esr2a和esr2b而非esr1。因此,我们将2-4 dah WT XX鱼腹腔注射PHTPP,在180 dah时,性腺组织学分析显示其发生由雌向雄的性逆转。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得esr1纯合突变体,结合并利用实验室前期已建立的esr2a和esr2b纯合突变体,分析其性腺表型,发现esr1对于卵子发生和精子发生是非必需的;esr2a对于雌性卵子发生和雄性育性及精子活力是必需的;esr2b对于雌性输卵管和雄性的输精管发育是必需的。三个esr的单敲除均不会发生由雌向雄的性逆转,esr介导雌激素在配子发生和性别决定中的关键作用仍不清楚。进一步对esr2a+/-esr2b+/-XX鱼分析发现,其发生雄性化现象。用esr2特异的拮抗剂PHTPP腹腔注射WT XX鱼,导致其发生由雌向雄的性逆转,表明与斑马鱼一致,在罗非鱼中,雌激素在性别分化和配子发生中的作用主要是通过esr2a和esr2b介导。本研究丰富了esr1、esr2a和esr2b在鱼类生殖中的功能及esr介导雌激素调节性别分化和配子发生的分子机制的认识。esrs双敲除甚至三敲除突变体的建立工作仍在进行中。