研究背景：　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是东南亚地区包括我国南部省份常见的恶性肿瘤之一。本研究首先以鼻咽癌CNE2细胞系为研究对象，利用流式细胞仪技术检测多种常见肿瘤干细胞标记物在其中的表达，初步确定鼻咽癌干细胞的候选特异性表面标记。经免疫磁珠分选后，进一步选择3种调控干细胞多能性及自我更新的转录因子Oct3/4、Nanog和Sox2作为检测指标，应用细胞免疫荧光显色技术，检测目标细胞中3种抗体共表达的情况。探讨鼻咽癌肿瘤干细胞存在的可能。其次，在获得了表达特异性抗原细胞的基础上，通过一系列试验，从细胞周期、细胞分化、细胞增殖活性以及体外体内成瘤能力方面，鉴定该亚群细胞是否具备强大的自我更新和分化潜力，是否拥有高成瘤性。初步阐明鼻咽癌干细胞相关亚群的生物学行为特征，为进一步探索其分子调控机制奠定坚实的理论基础。最后，为了更接近于人体内肿瘤的生物学特性，我们立足于鼻咽癌原代细胞的培养，通过一系列体内、体外试验探讨相同的特异性标记物在原代细胞中的表达情况。鉴定其分选后的亚群细胞是否同样具备肿瘤干细胞的特征。明确鼻咽癌原代细胞模型和已建系的细胞株模型在研究肿瘤干细胞中的异同。为今后进一步创造更接近于人体内肿瘤生长微环境的试验模型提供理论依据。　　 一、人鼻咽癌细胞株CNE2肿瘤干细胞标志的探讨　　 目的：初步确定鼻咽癌干细胞的候选特异性细胞表面标记物。　　 方法：以人鼻咽癌CNE2细胞系为研究对象，利用流式细胞仪技术检测候选干细胞标志CD34、CD44、CD133在细胞膜中的表达。初步选择CD133作为鼻咽癌干细胞的候选特异性标记进行分选。经免疫磁珠法分选后，应用细胞免疫荧光显色技术，检测CD133+及CD133-亚群细胞中Oct3/4、Sox2和Nanog3种抗体共表达情况。　　 结果：1、鼻咽癌细胞株CNE2细胞中膜抗原CD133呈低度稳定表达，表达率为3.36％±0.35％；CD44则大量表达，表达率为82.79％±0.99％；CD34表达较多，表达率为11.76％±1.22％。　　 2、免疫荧光细胞染色显示CD133+细胞可同时表达2个调控干细胞多能性的标记物Nanog和Sox2。不表达Oct3/4。　　 3、免疫磁珠分选效率稳定可靠，分选效率平均为89.15％±7.80％。　　 结论：1、CD133可以作为鼻咽癌肿瘤干细胞的候选特异性表面标记物。　　 2、免疫磁珠分选技术是分离提纯鼻咽癌细胞株中CD133+细胞亚群的有效方法。　　 二、鼻咽癌细胞系CNE2中CD133+细胞的生物学特性初探　　 目的：探讨鼻咽癌细胞系CNE2细胞中CD133+及CD133-亚群细胞体外培养的生物学特征和体内成瘤能力　　 方法：以人鼻咽癌CNE2细胞系为研究对象，首先用免疫磁珠分选法得到CD133+细胞及CD133-细胞，随后通过MTT比色法测定两亚群细胞的增殖能力，绘制生长曲线；平板克隆形成试验比较两亚群细胞的体外克隆形成能力；应用流式细胞仪测定细胞周期的分布特点并计算细胞增殖指数；应用流式细胞仪动态监测分选纯化后的CD133+细胞在体外培养中CD133抗原表达的变化情况；通过无血清悬浮培养检测两亚群细胞的克隆球形成能力；通过裸鼠成瘤试验，检验两亚群不同数量的细胞在体内的成瘤能力；HE染色检验种植瘤的病理组织类型；原代培养种植瘤的肿瘤细胞，并使用流式细胞仪检测移植瘤细胞中CD133表面抗原的表达。　　 结果：1、两亚群细胞的生长曲线、体外克隆试验表明， CD133+细胞的自我更新和增殖成瘤能力明显大于CD133-细胞(P＜0.05)　　 2、在1个月的观察期内，1×105数量的CD133+细胞可以在裸鼠背部成瘤，而CD133-细胞不能成瘤。　　 3、两亚群细胞的细胞周期分布特点以及细胞增殖指数无统计学差异。　　 4、分选出的CD133+细胞在含5％胎牛血清的RPM11640培养基生长，大部分细胞在增值过程中转变为其他表型的细胞，培养至21天后，仅0.37％±0.10％的细胞表达CD133。　　 5、在无血清培基中，CD133+肿瘤细胞可以悬浮生长，形成类似肿瘤克隆的细胞球，而CD133-细胞则大部分凋亡，仅少数贴壁缓慢生长。　　 6、种植瘤组织经HE染色检查证实为低分化非角化型癌。原代培养细胞形态与CNE2细胞相似。流式细胞仪检测结果显示，CD133阳性细胞约占总数的2.17％±0.46％。　　 结论：1、鼻咽癌细胞株CNE2中，CD133+表型细胞与CD133-表型细胞相比，在体外具有更强的自我更新和克隆成瘤能力；膜抗原CD133呈低度稳定表达。　　 2、鼻咽癌细胞株CNE2中，CD133+表型细胞与CD133-表型细胞相比，在裸鼠体内具有更强的成瘤能力。　　 3、鼻咽癌细胞株CNE2中，CD133+表型细胞具有分化为其他表型细胞的能力。　　 4、鼻咽癌CNE2细胞株中，CD133+细胞亚群的细胞周期分布特点及细胞增殖指数与CD133-细胞亚群相比，无统计学上的差异。　　 三、人鼻咽癌原代细胞培养及肿瘤干细胞的分选、鉴定　　 目的：探讨鼻咽癌原代细胞中CD133+及CD133-亚群细胞体外培养的生物学特征和体内成瘤能力。比较原代细胞与细胞株试验模型的异同点。　　 方法：应用组织块培养法得到鼻咽癌原代细胞后，先用免疫磁珠分选法得到CD133+细胞及CD133-细胞，随后通过用MTT比色法测定两亚群细胞的增殖能力，绘制生长曲线；平板克隆形成试验比较两亚群细胞的体外克隆形成能力；通过体内成瘤试验，检验两亚群不同数量的细胞在体内的成瘤能力。　　 结果：1、人鼻咽癌原代细胞可以在Keratinocyte-SFM培养基中增殖生长，经角蛋白(CK)荧光染色表明所培养细胞均为上皮来源。　　 2、人鼻咽癌原代细胞培养成活率在40％-60％,各株肿瘤细胞增殖传代能力不同。存活期在2代到6代之间。而且生长最旺盛者，表达CD133表面抗原越多。其中一株表达CD133表面抗原稳定在2.8±0.17％左右。　　 3、两亚群细胞的生长曲线、体外克隆试验表明，鼻咽癌原代细胞中CD133+细胞的体外增殖成瘤能力大于CD133-细胞(P＜0.05)。　　 4、原代培养的鼻咽癌细胞分别以1×104及1×105的数量注入NOD/SCID小鼠(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷)的皮下，在21-30天的观察期内，CD133+及CD133-亚群的细胞均未见瘤块形成。　　 结论：1、采用组织块培养法，应用Keratinocyte-SFM培养基，可培养出相对纯化的人鼻咽癌原代细胞。各株细胞增殖传代能力不同，生长最旺盛者，表达CD133表面抗原最多。　　 2、鼻咽癌原代细胞中CD133+表型细胞与CD133-表型细胞相比，在体外具有更强的自我增殖和克隆成瘤能力。(P＜0.05)　　 3、鼻咽癌原代细胞与CNE2细胞株相比，在肿瘤干细胞的构成比例上有所减少；在相同的条件下，细胞的自我更新能力、克隆形成能力以及体内致瘤能力均有下降。经免疫磁珠分选后，鼻咽癌原代细胞的生长增殖能力受到更明显的影响。　　 根据以上结论，结合肿瘤干细胞的特点，我们认为CD133+表型细胞是鼻咽癌肿瘤干细胞的富集群。CD133可以作为鼻咽癌肿瘤干细胞的特异性表面标记物。