本文是长春市振兴东北老工业基地科技攻关项目“玉米淀粉酶法浸泡生产工艺”的部分研究内容。目的是寻找一种提高淀粉得率,缩短生产周期,减少环境污染,突破传统淀粉生产工艺束缚的新方法。通过在玉米浸泡液中添加选育的产酶高峰期蛋白酶发酵液的方法,有针对性地调整玉米浸泡环境,利用蛋白酶替代SO2降解包裹玉米淀粉颗粒的蛋白质,达到降低生产成本,基本取代SO2的目标。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是生产碱性蛋白酶的重要菌种之一,本实验室保藏的这类菌株的碱性蛋白酶产量较低,但对诱变因素敏感、变异幅度大、正突变率高,因而可利用诱变育种的方法进行改进。玉米淀粉的生产加工过程中,去除包裹淀粉颗粒的蛋白质是一个必不可少的重要步骤。现在淀粉工厂中主要采用的SO2浸泡法会造成环境污染,所以研究新的、环保的方法已成为必然。本文通过对本实验室保藏的地衣芽孢杆菌的原生质体进行紫外线诱变选育,筛选出一株产蛋白酶能力好、酶活力高、能够高效分解玉米蛋白质的菌株;然后通过在玉米浸泡液中添加该菌株产酶活性高峰期的发酵液,在保证浸泡效果、淀粉得率的同时降低浸泡水中亚硫酸的浓度,缩短浸泡时间。具体研究内容如下:1.以本实验室保藏的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为出发菌株,研究了其原生质体形成及再生的各种影响因素,得出原生质体形成及再生的最适条件为:从新鲜斜面上取1环菌接入30mL完全培养基(CM)中,30℃振荡培养l0h,以1%接种量转接到新鲜的30mLCM液中振荡培养至对数生长中期(6h),同时加1mg/mL甘氨酸与0.4u/mL青霉素,继续培养至对数生长末期(10h)。取菌液离心去掉培养液,洗涤菌体,然后用2mg/mL溶菌酶37℃静止作用6h,使之形成原生质体后用双层平板法分离原生质体(稳定剂为琥珀酸钠),测得原生质体的形成率和再生率分别为93.6%和36.5%。在原生质体形成及再生的最适条件下,将地衣芽孢杆菌制备成原生质体,通过二次紫外线诱变,并以Folin-酚法测定突变株的酶活,从大量突变株中筛选出16号菌株。其酶活性最高,比出发菌株的酶活提高了178.6%,且遗传性比较稳定,因此将16号突变菌株作为后续研究菌株。2.对地衣芽孢杆菌16号突变菌株进行摇瓶发酵工艺的研究,得到其最适的发酵条件为:种龄12h,接种量2%,装液量25 mL /250mL,摇床转速210r/min,30℃下发酵44h。通过对发酵液采用硫酸铵分级盐析、透析、DEAE-Sephadex-A-50、CM-Sephadex-C-50层析等方法对酶进行纯化。SDS-PAGE表明纯化后的样品已达到电泳纯,分子量为28.5kDa。通过酶学性质的研究可知:当底物为酪蛋白时,酶的最适作用pH值为10.0,最适作用温度为55℃。该酶在pH5-11之间,40-60℃的范围均保持较高活力;并且该酶对SDS有较强的耐受性。Ag2+、Cu2+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Mg2+对酶稍有激活作用。3.通过单因素试验及正交试验,利用DPS统计软件进行方差分析,表明酶的作用时间和亚硫酸含量对淀粉得率的影响显著。同时采用SSR法进行多重比较,对各因素和各组合进行比较,得到最优组合为添加0.1%的亚硫酸与0.5%的乳酸在浸泡液中浸泡18h后,将玉米籽粒去皮去胚,之后调pH值为7.0;接着加入20%的蛋白酶发酵液,继续浸泡6h。此结论与前述单因素试验的结果基本相同。实验室模拟传统浸泡条件获得的淀粉得率为58.29%,以此方法获得的淀粉得率为67.79%,比传统方法提高了9.5个百分点,并且总的浸泡时间由原来的36h缩短至24h。