论文部分内容阅读
布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的一类人兽共患的慢性传染病，目前在我国以及世界上大多数国家有比较广泛的流行。布鲁氏菌的主要宿主是人和动物，当人类感染之后可引起波浪热、关节炎、肌肉疼痛等临床症状；动物感染主要表现为母畜流产、公畜睾丸炎等，近几年该病又有上升趋势，严重危害了人类的安全和社会经济的发展。目前对于布鲁氏菌的致病机制还不清楚，OMP10和OMP19是布鲁氏菌的两个主要的外膜蛋白，也是两个关键的毒力因子，对布鲁氏菌在胞内的生存起到关键作用。本文主要研究这2个外膜蛋白对小鼠巨噬细胞胞内布氏小体与溶酶体融合的影响以及对其凋亡的影响，为研究布鲁氏菌外膜蛋白对其胞内生存的机制奠定基础。1.布鲁氏菌2308株omp10和omp19基因缺失株的构建及鉴定。以枯草芽孢杆菌为模板高保真扩增SacB基因；以牛种布鲁氏菌2308为模板高保真扩增omp10和omp19基因上下游同源臂，通过融合PCR技术将omp10和omp19基因上下游同源臂融合，将融合片段与SacB基因连接到pGEM-7zf+，构建pGEM-7zf-omp10-SacB（p10S）和pGEM-7zf-omp19-SacB（p19S）。制备牛种布鲁氏菌2308感受态，电转化重组质粒p10S和p19S，通过氨苄、蔗糖的两次筛选得到阳性菌落，进行遗传稳定性检测；并且在小鼠巨噬细胞RAW264.7水平初步验证Δomp10和Δomp19的胞内生存能力；在小鼠个体水平初步验证Δomp10和Δomp19的体内生存能力。结果布鲁氏菌Δomp10和Δomp19传15代之后没有出现回复突变，且Δomp10和Δomp19与亲本株2308侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7之后强毒株的胞内菌数量在4h之后呈上升趋势，Δomp10和Δomp19在4h之后则呈下降趋势；Δomp10和Δomp19与亲本株2308在小鼠体内检测发现Δomp10在小鼠体内的生存能力最低，Δomp19其次。实验结果表明Δomp10和Δomp19具有一定的遗传稳定性，且与亲本株2308相比其胞内生存能力和体内生存能力较弱。2.布鲁氏菌Δomp10和Δomp19对小鼠巨噬细胞内溶酶体融合的影响。Δomp10和Δomp19与亲本株2308侵染小鼠巨噬细胞。通过免疫荧光技术，绵羊抗牛种布鲁氏菌IgG抗体、罗丹明标记的驴抗绵羊IgG抗体和细胞溶酶体染色试剂盒标记小鼠巨噬细胞内的布鲁氏菌和溶酶体，激光共聚焦显微镜观察细胞内布氏小体与溶酶体的融合率。结果Δomp10和Δomp19组胞内的布氏小体与溶酶体的融合效率在90%以上，而亲本株2308的融合效率初期维持在10%左右，后期在70%左右。结果表明Δomp10和Δomp19与亲本株2308相比不能够抑制胞内布氏小体与溶酶体的融合。3.布鲁氏菌Δomp10和Δomp19对小鼠巨噬细胞凋亡的影响。Δomp10和Δomp19与亲本株2308侵染小鼠巨噬细胞。收集侵染之后的细胞大约1-5×10~5个，各个样品加入BindingBuffer悬浮细胞，依次加入AnnexinV-FITC和PI，混匀，室温、避光反应5-15min，1h流式细胞仪检测小鼠巨噬细胞的凋亡情况。结果亲本株2308组小鼠巨噬细胞的凋亡率基本上维持在20%左右，Δomp10组小鼠巨噬细胞的凋亡率是在30%-40%之间，Δomp19组小鼠巨噬细胞的凋亡率也是在20%左右。结果表明亲本株2308组与对照组相比能够抑制小鼠巨噬细胞的凋亡，Δomp10不能够抑制小鼠巨噬细胞的凋亡，而Δomp19小鼠巨噬细胞的凋亡率与亲本株无明显差异。4.本文研究结果表明布鲁氏菌Δomp10和Δomp19具有一定的遗传稳定性，其胞内生存能力与亲本株2308相比有一定程度的下降；Δomp10和Δomp19与亲本株2308相比两者不能抑制小鼠巨噬细胞内布氏小体与溶酶体的融合；Δomp10与亲本株2308相比不能抑制小鼠巨噬细胞的凋亡而Δomp19与亲本株2308相比对小鼠巨噬细胞的凋亡处于相同水平。