【摘 要】
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黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）是世界范围内广泛栽培的蔬菜作物之一。随着我国设施栽培黄瓜面积的不断扩大,土壤连作障碍现象日益突出,其中,黄瓜枯萎病已成为设施黄瓜连作障碍最突出的表现,严重制约了黄瓜的优质高效栽培。因此,挖掘枯萎病抗性基因进而创制黄瓜抗枯萎病品种具有迫切的生产需求。实验室前期对68份黄瓜自交系进行了枯萎病抗性鉴定,发现不同黄瓜自交系苗期对枯萎病的抗性存在
【基金项目】
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江苏省农业科技自主创新基金（编号:CX（19）3029）
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黄瓜（Cucumis sativus L.,2n=2x=14）是世界范围内广泛栽培的蔬菜作物之一。随着我国设施栽培黄瓜面积的不断扩大,土壤连作障碍现象日益突出,其中,黄瓜枯萎病已成为设施黄瓜连作障碍最突出的表现,严重制约了黄瓜的优质高效栽培。因此,挖掘枯萎病抗性基因进而创制黄瓜抗枯萎病品种具有迫切的生产需求。实验室前期对68份黄瓜自交系进行了枯萎病抗性鉴定,发现不同黄瓜自交系苗期对枯萎病的抗性存在显著差异,确定‘日节成’和‘Superina’分别为耐枯萎病与感枯萎病自交系。基于此,本研究以耐枯萎病的‘日节成’为试材,在真叶期接种黄瓜枯萎病菌,于接菌后不同时间点（0,48和96 h）取根系进行miRNA测序分析;进而利用双荧光素酶实验、qRT-PCR、病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）技术、酵母双杂交等技术分析应答枯萎病菌接种的miRNA的靶基因功能。主要研究结果如下:1.miRNA测序分别获得390和755个成熟与发夹miRNA,其中,相对于对照处理,1 1个miRNA在枯萎病接种后显著上调表达;qRT-PCR进一步验证miRNA的表达水平,发现miR6300和miR319a在黄瓜接种枯萎病菌后明显下调表达。在接种枯萎病的‘日节成’中qRT-PCR分析发现,miR6300和miR319a的21个靶基因中,miR319a对应的靶基因 CsJRL3（Jacalin-like lectin domain,Csa2G362470）,miR6300对应的靶基因CsBEE1（Helix-loop-helix DNA-binding domain,Csa1G024150）、CsDAHP1（Class-Ⅱ DAHP synthetase,Csa2G369040）和 CsPERK2（SPOC domain,Csa4G642480）显著上调表达;进一步通过双荧光素酶实验分析了miR6300和miR319a与其对应靶基因的互作关系,初步明确CsBEE1、CsJRL3、CsDAHP1、CsPERK2为黄瓜抗枯萎病的候选基因。2.利用黄瓜绿斑驳病毒（CGMMV）介导的VIGS技术在黄瓜中分别沉默黄瓜抗枯萎病候选基因CsBEE1、CsJRL3、CsDAHP1和CsPERK2,通过枯萎病菌接种后的表型鉴定、发病率比较分析及组织染色发现,沉默CsBEE1显著降低枯萎病的抗性。‘日节成’受水杨酸诱导后CsBEE1表达量显著上调,沉默CsBEE1后内源水杨酸含量显著下调,可见CsBEE1参与水杨酸的合成。通过酵母双杂交技术筛选到1 1个CsBEE1的互作蛋白,进一步结合枯萎病菌接种‘日节成’并进行转录组测序,筛选出3个差异表达基因:CsNRRL1（Haem peroxidase,Csa4G285760）、CsCAB1（Chlorophyll A-B binding protein,Csa6G139 750）和 CsCHS2（Concanavalin A-like lectin,Csa7G044980）,对其进行qRT-PCR验证发现,CsNRRL1和CsCAB1差异显著,推测CsBEE1可能通过调控CsNRRL1和CsCAB1的表达进而参与对枯萎病的防御反应。本研究为今后筛选黄瓜抗枯萎病基因、黄瓜抗枯萎病分子遗传改良和种质创新利用奠定了初步的理论基础。
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