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泛素蛋白酶体降解途径是细胞内普遍存在的蛋白质降解途径,在这个过程中,蛋白质的泛素化与去泛素化是一个动态平衡的过程。泛素是一个含有76个氨基酸,分子量为8.5KD的蛋白质。目前对去泛素化酶的研究越来越成为热点。去泛素化酶有五大家族,而其中USP家族是数量最庞大的一个家族。在USP家族中,有定位于细胞核的去泛素化酶,有定位于细胞核仁的去泛素化酶,有定位于细胞质的去泛素化酶。还有定位于细胞核和细胞质的去泛素化酶。去泛素化酶的不同的定位也行使着不同的功能。在定位于细胞核的去泛素化酶中又以去泛素化酶USP42的定位比较特别。另外SC35又是核斑的标志蛋白,定位于核斑的蛋白大多行使着与m RNA前体剪接相关的功能。SC35也是一个著名的剪接因子,可与其他剪接相关蛋白形成复合体。本课题以研究去泛素化酶USP42在细胞内的定位为切入点,探究了影响其在细胞内定位的功能域,并初步探究其在肿瘤中有可能的作用机制,以期待USP42可能成为肿瘤治疗的新靶点。在本课题研究中发现影响去泛素化酶USP42定位于细胞核的结构域为其C端,而影响其在细胞核内所形成的特别形状的功能域为其C端的赖氨酸富集区及精氨酸富集区。同时我们也明确了去泛素化酶USP42与SC35存在共定位,且找到了去泛素化酶USP42上影响其与SC35共定位的功能域,并发现去泛素化酶USP42与SC35的共定位是USP42酶活依赖的。在研究中我们也证实了去泛素化酶USP42对SC35的影响是非直接相互作用的。接下来我们将探究去泛素化酶USP42直接作用的蛋白,从而进一步了解USP42在肿瘤中的作用。目的:明确去泛素化酶USP42的细胞内定位,及影响其定位的功能域。明确去泛素化酶USP42与SC35的共定位,且找出影响这种共定位的USP42的功能域。探究去泛素化酶USP42与SC35的相互作用。方法:通过分子克隆的方法构建去泛素化酶USP42的不同功能域缺失及酶活位点突变的的结构,并使他们都带上GFP标签;通过Western blotting检测所构建的载体是否都能够表达,同时用免疫荧光的方法探究不同结构域缺失以及突变体在细胞中的定位情况。在不同的细胞系内用免疫荧光的方法探究内源性的USP42与SC35的共定位情况。以所构建的带有GFP标签的不同功能域缺失以及突变体的载体转染细胞,用免疫荧光的方法检测其与SC35的共定位情况,从而探究影响USP42与SC35共定位的USP42的功能域。在293T中共转染带有不同标签的USP42及SC35的质粒,用免疫共沉淀的方法探究USP42与SC35的相互作用。结果:将构建的去泛素化酶USP42的不同结构域缺失及突变体通过Western blotting检测,证实其都是能够正常表达的。用免疫荧光的方法看到的不同结构域缺失以及突变体在细胞内的定位情况,观察到只有当C端存在时才会与野生型的USP42一样在细胞核内形成点状。且C端的赖氨酸富集区及精氨酸富集区的存在是其在细胞核内成点状分布的重要因素。在H1299,H1650,SKBR3,HCC827细胞系中看内源性USP42与SC35的共定位情况,观察到在H1650细胞中USP42与SC35的共定位最明显。同时也观察到单外源性以及双外源性的USP42与SC35有明显的共定位。在实验中还证实了USP42与SC35的共定位是RNA非依赖的。用免疫荧光的方法观察USP42不同结构域缺失及突变体与SC35的共定位,发现野生型USP42与SC35有明显共定位,且USP42的不同功能域中,当赖氨酸富集区及精氨酸富集区缺失后与SC35无明显共定位。当USP42的酶活位点突变后与SC35也无明显共定位。在实验中我们将USP42不同功能域缺失及突变体转染293T细胞后,用Western blotting检测其对SC35表达的影响,发现对其SC35的表达是有影响的,而免疫共沉淀实验中,我们将USP42及SC35的质粒转染进297T细胞,分别用其所带的不同标签抗体进行试验,结果两者都无法相互沉淀下来。结论:1.影响去泛素化酶USP42在细胞内的定位情况的功能域为其C端的精氨酸富集区以及赖氨酸富集区。2.USP42与SC35有共定位,且这种共定位是RNA非依赖的。3.影响去泛素化酶USP42与SC35共定位的为USP42的赖氨酸富集区及精氨酸富集区,且USP42与SC35的共定位是USP42酶活依赖的。4.USP42对SC35有影响,但USP42与SC35的相互作用是非直接相互作用。