蜡蚧菌是一种重要的虫生真菌,对于温室害虫具有良好的防治效果,但是由于其作用过程慢、效果容易受环境的影响,所以在实际应用中受到很大的限制。在蜡蚧菌侵染害虫的过程中,其分泌的蛋白酶、几丁质酶等胞外酶具有重要作用。研究发现,增加生防真菌胞外酶的分泌,能显著地提高真菌的毒力水平。本研究从白僵菌中克隆得到一个蛋白酶基因,将其导入蜡蚧菌中,提高蜡蚧菌的蛋白酶分泌水平,以此改良蜡蚧菌菌株。主要研究结果如下:1.克隆外源蛋白酶基因。从一株性状优良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因Cdep1,根据GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因设计引物,同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。经Blast比对,其与白僵菌蛋白酶基因(HQ840791)的序列同源性为99%。其对应的氨基酸序列与碱性丝氨酸蛋白酶(KGQ12177)的同源性为99%,其中第128位的氨基酸由丝氨酸突变为酪氨酸,239位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。2.构建了Cdep1蛋白酶的真菌表达载体。以质粒pAN7-1为模板,分别克隆得到启动子GdpA、终止子TrpC。采用重叠PCR的方法,结合降落PCR,构建片段GdpA-Cdep1-TrpC(4021bp)。质粒pBht2和连接片段经过Kpn I和HindIII酶切后,使用T4连接酶将该片段与真菌表达质粒pBht2连接,构建了其表达的重组质粒。3.应用了农杆菌转化法和原生质体转化法转化蜡蚧菌。使用重组质粒转化农杆菌感受态,阳性农杆菌在与蜡蚧菌分生孢子共培养2天后转接到抗性平板中,培养至可见单菌落进行验证,结果获得大量的转化子,随机挑选100个转化子做进一步的鉴定。对蜡蚧菌的原生质体转化的条件进行了优化,结果表明蜡蚧菌孢子以1.5×108的浓度接种到土豆液体培养基中,培养24小时,按照1:40的比例加入复配的30mg/mL的裂解液(溶菌酶:纤维素酶:蜗牛酶=2:1:1),酶解3小时,蜡蚧菌的原生质体数量可以达到1.8×107个/g。4.转化子拷贝数鉴定。根据已报道的单拷贝基因EF1α设计扩增内参引物,采用Beacon Designer设计目的基因引物AM-3,使用荧光定量PCR技术,对28个转化子进行拷贝数检测。在消除扩增效率和扩增片段大小的差异后,结果显示转化子中单拷贝的有9株,两拷贝和三拷贝的各有1株。保留单拷贝的菌株用于酶活性评价。5.转化子酶生物活力评价。使用紫外分光光度计,通过对蛋白酶水解酪素产生的酪氨酸含量的测定,检测阳性菌株的蛋白酶活力,结果显示,转化子酶活性最高比出发菌株提高了10倍,具有进一步研究的价值。