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一,研究背景在我国,胃癌(Gastric Cancer,GC)在消化系统恶性肿瘤中的发病率和死亡率均居首位。胃癌的发生及发展受到多因素的影响,预后差。因此,研究胃癌发生发展的分子机制,开辟新的胃癌早期诊断指标和潜在治疗靶点,对治疗胃癌具有极重要的意义。microRNAs是一类具有调控功能的非编码RNA。研究发现microRNAs参与多种信号调节通路,它们调控的靶基因关系着肿瘤的分化、增殖、凋亡、侵袭、迁移和血管新生等各方面。血管新生为肿瘤发展必不可少的环节,大量研究证明,miRNA参与了肿瘤血管新生的过程,在肿瘤的血管新生中扮演重要角色。miR-125a-5p为miR-125a的成熟体之一,miR-125a加工成miR-125a-5p和miR-125a-3p才能发挥其生物学功能,已经研究证实miR-125a-5p在胃癌中参与HER-2信号通路的调控,本研究旨在更加深入的探讨miR-125a-5p在胃癌中的功能及可能机制。二、研究目的我们的目的是阐明miR-125a-5p转染的胃癌AGS细胞对HUVECs增殖、迁移能力等生物学行为,研究裸鼠成瘤模型中肿瘤生长的影响及机制研究,探讨miRNA-125a-5p在人胃癌组织中的表达并分析其与临床病理参数的关联及临床意义。三、研究内容1.生物信息学分析40余种不同胃癌细胞系中miR-125a DNA拷贝数情况;qRT-PCR验证分析胃癌细胞系SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p的表达情况；qRT-PCR、Western blot和ELISA分别被用来检测miR-125a-5p mimics和inhibitors转染AGS细胞后胞内VEGF-A的mRNA、蛋白水平以及培养液中的VEGF-A浓度；Lucifease assay被用来验证VEGF-A是否为miR-125a-5p的靶基因。2.将miR-125a-5p mimics和miR-125a-5p inhibitors转染的AGS细胞与HUVECs共培养。CCK-8和平板克隆形成实验、Transwell迁移及体外小管形成实验被分别用来检测miR-125a-5p转染AGS细胞对HUVECs细胞的增殖、迁移及小管形成能力的影响;MK-2206 2HCI (Akt活性抑制剂)被用来检测miR-125a-5p对VEGF-A下游信号通路的影响。3. 构建AGS胃癌细胞裸鼠成瘤模型后,qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-125a-5p及VEGF-A的mRNA表达水平;Western blot和IHC检测肿瘤组织中VEGF-A蛋白表达水平;IHC检测移植瘤组织中的CD31表达状况(微血管)。4. qRT-PCR检测73例胃癌标本中miR-125a-5p表达水平。IHC检测组织标本中VEGF-A、HER、Ki-67、E-cadherin表达水平以及CD31的表达状况,并分析其与临床病理指标的相关性,并做回顾性分析。5. 利用生物信息学分析胃癌中与VEGF-A表达相关的miRNAs。四、研究结果1.生物信息学资料显示,各细胞系中miR-125a的DNA拷贝数差异较大。RT-PCR结果显示SGC-7901、AGS、BGC-823中miR-125a-5p表达均低于正常胃粘膜上皮细胞GES-1(p<0.05)。miR-125a-5p mimics转染AGS可降低VEGF-AmRNA和蛋白表达,相对于对照组具有统计学差异(p<0.05)；而miR-125a-5pinhibitors转染AGS可使VEGF-A mRNA和蛋白表达增高,相对于对照组也具有统计学差异(p<0.05)。通过预测发现VEGF-A可能是miR-125a-5p的靶基因,而Lucifease assay验证了miR-125a-5p可以结合VEGF-A的3’UTR并抑制其表达。2.将miR-125a-5p mimics和inhibitors转染的AGS与HUVECs共培养。功能学分析显示,miR-125a-5p mimics可减少AGS细胞VEGF-A分泌,降低HUVECs增殖、迁移以及小管形成能力：而miR-125a-5p inhibitors增加AGS细胞VEGF-A分泌,增强HUVECs增殖、迁移以及小管形成能力,且Akt抑制剂可以逆转高浓度VEGF-A带来的这种增强效应(p<0.05)。3.我们成功使用AGS细胞构建胃癌BALB/C裸鼠移植瘤模型,待瘤体长至50mm3时,在对照组和实验组瘤中和瘤周分别注射Control agomir和miR-125a-5p agomir 4周,结果显示,对照组平均移植瘤重及体积均比实验组大,两者存在显著差异(P值均<0.05)。RT-PCR结果显示对照组肿瘤组织中miR-125a-5p表达量比实验组肿瘤中表达量低(p<0.05),同时Western blot显示VEGF-A表达量高(p<0.05),微血管密度分析显示MVD与VEGF-A表达成正相关(r=0.5495),与miR-125a-5p表达成负相关(r=-0.7419)。4.73例胃腺癌组织标本分析显示,肿瘤组织较癌旁正常组织而言miR-125a-5p表达降低,其表达量与肿瘤淋巴结转移(P=0.019)、临床分期(P=0.001)、MVD (P=0.002)、HER-2表达(P=0.007)、VEGF-A表达(P=0.001)相关。对VEGF-A的表达进行量化分析发现,VEGF-A表达与miR-125a-5p表达呈负相关(r=-0.5382)、与MVD呈正相关(r=0.7226)：与此同时miR-125a-5p表达与MVD呈负相关(r=-0.4554)。最后生存分析显示,低表达miR-125a-5p、高表达VEGF-A、高MVD均不利于预后,对miR-125a-5p进行meta-analysis后发现其为独立预后因素。5. 生物信息学分析筛选,let-7c、miR-100、miR-143与VEGF-A表达成负相关(r均<0.4,p值均<0.05)。而let-7g、miR-16-1、miR-15b、miR-126、miR-30b、 miR-191、miR-455、miR-200c、miR-500a与VEGF-A表达成正相关(r均>0.4,p值均<0.05)。五、研究结论1. miR-125a-5p通过靶向调节胃癌细胞VEGF-A的分泌影响肿瘤血管新生。2. miR-125a-5p agomir通过负向调节VEGF-A的分泌抑制肿瘤生长,是胃癌的潜在治疗靶点。3. miR-125a-5p在人胃癌中表达降低,且与VEGF-A表达负相关,影响血管新生,不利于患者预后。4. 对胃癌中与VEGF-A表达相关的miRNA做出了初步筛选,为后期研究奠定基础。