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子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EMC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,占女性全身恶性肿瘤的7%,占女性生殖道恶性肿瘤的20-30%,平均发病年龄60岁。EMC在发达国家发病率呈上升趋势,美国年新发子宫内膜癌病例约4万多例,我国EMC发病率也呈逐年上升趋势,严重威胁女性健康。关于EMC的病因学及发病机制,“unopposed estrogen”学说,也就是无孕激素抵抗的雌激素对子宫内膜的过度刺激是目前普遍认可的原因,但EMC具体发病机制至今仍不十分清楚。目前针对EMC分子机制的研究正在不断深入,其发生发展机制及靶向治疗受到广泛关注。临床中观察到,子宫内膜癌患者多合并肥胖、糖尿病、高血压,提示我们内膜癌与糖脂代谢有着密切关系。糖尿病是一种常见的慢性病。流行病学研究表明,糖尿病尤其是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者,存在胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),其患癌及癌症死亡的危险性显著升高。癌症和糖尿病的发病率和死亡率随着年龄的增长而增加,目前这两种疾病发病年龄有趋于年轻化的倾向。meta分析显示糖尿病是多种类型癌症发生发展的独立危险因素,如EMC、乳腺癌、结直肠癌等。存在IR的T2DM与子宫内膜癌关系密切,IR导致的高胰岛素血症是独立于雌激素的导致内膜癌的高危因素。越来越多的流行病学证据表明,与IR有关的疾病,同时也是EMC的高危因素,如肥胖、T2DM、多囊卵巢综合征、代谢综合征等,均存在IR,都是EMC高发人群。IR和EMC在分子水平上受共同因子调控,如炎症介质、脂肪因子、过高雄激素等。虽然糖尿病和EMC发病风险间关系的机制还不是很清楚,但已有研究表明胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)是重要的因素。IGFs包括胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)及胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 1,IGF-2)。IGF-1作用的信号通路和肿瘤密切相关。IGF-1与细胞表面胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)结合,激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)/Akt信号通路,促进细胞的生长和增殖,抑制细胞凋亡。在肥胖个体中,由于IGF结合蛋白浓度的降低,导致自由/活性IGF-1水平普遍高于非肥胖个体。另有研究显示,IGF-1可促进正常细胞周期,导致其突变和恶性转化的风险增加。IGF-1可由生长板或其他组织的旁分泌产生,但大多数循环中的IGF-1由肝脏合成和分泌。与胰岛素类似,抑制IGF-1信号有抗癌作用。敲除GF-1受体可增强某些癌症的化疗敏感性。IGF-1受体抗体已被开发作为一种治疗方法,而最近的研究表明其在体外对某些癌细胞有抑制作用。然而IGF-1、IGF-2及其受体在存在胰岛素抵抗的T2DM患者发展为EMC过程中潜在的机制,目前尚不清楚。本课题探讨IGF-1、IGF-2及其受体在EMC发病中的作用,为EMC的靶向治疗提供依据。第一部分T2DM合并EMC患者血清和子宫内膜细胞中IGF-1、IGF-2相关分子的表达研究目的:以EMC阳性及阴性的T2DM患者为研究对象,检测患者血清中IGF-1、IGF-2、IGFBP-3的表达;检测患者子宫内膜细胞中pIGF-1R、pIGF-2R、p-PI3K的表达,探索IGf-1及IGF-2及其受体与EMC发病的关系。方法:选择T2DM患者162例,其中合并EMC的患者22例为实验组,不合并EMC的患者140例为对照组,抽取空腹血,通过ELISA方法检测两组患者血清中IGF-1、IGF-2、IGFBP-3的水平。通过诊断性刮宫或于子宫切除术中,获取患者子宫内膜,进行体外细胞培养,通过Western blot方法检测两组患者的子宫内膜细胞中pIGF-1R、pIGF-2R、p-PI3K蛋白表达水平。结果:1 ELISA结果显示,与EMC阴性的T2DM患者血清相比,EMC阳性的T2DM患者血清中IGF-1和IGF-2水平无差异(P﹥0.05)。2 ELISA结果显示,EMC阳性及阴性的T2DM患者血清中IGF1BP3的水平无差异(P﹥0.05)。3 Western blot检测子宫内膜细胞中磷酸化IGF-1R的水平在EMC阳性及阴性组患者无统计学差异(P﹥0.05);而EMC阳性的T2DM患者子宫内膜细胞中磷酸化的IGF-2R和IGF-1R下游因子PI3K水平显著高于EMC阴性的T2DM患者,有显著性差异(P<0.05)。这些数据表明,2型糖尿病患者子宫内膜细胞中存在一个复杂的由IGF-1R和IGF-2R信号调控的PI3K通路。结论:1血清中IGF-1及内膜细胞中pIGF-1R表达在EMC阳性及阴性组T2DM中无统计学差异,EMC阳性组患者内膜细胞中IGF-1的下游产物p-PI3K表达增加。2 EMC阳性组T2DM患者内膜细胞中存在pIGF-2R信号的激活,推测在T2DM患者发展为EMC的过程中,IGF-2R发挥重要作用。第二部分IGF-1、IGF-2对子宫内膜癌细胞生长和PI3K信号通路分子表达的影响目的:研究外源性IGF-1或IGF-2作用于子宫内膜癌细胞系HEC-1A后,磷酸化的IGF-1R、IGF-2R等因子的表达变化,以及对HEC-1A细胞生长速度的影响,探讨IGF-1、IGF-2及其受体在EMC发病中的潜在机制。方法:采用人子宫内膜癌细胞株HEC-1A,进行细胞培养,外源性加入IGF-1或IGF-2,处理1-2天,Western blot方法检测HEC-1A细胞中pIGF-1R、pIGF-2R、p PI3K和CCND1表达的变化,MTT方法检测加入不同生长因子后对HEC-1A细胞生长的影响。结果:1 Western blot分析结果显示:无论是IGF-1还是IGF-2处理组,HEC-1A细胞中pIGF-1R表达水平均明显高于无生长因子处理的对照组细胞(P<0.05),且IGF-1处理组pIGF-1R表达水平高于IGF-2处理组;IGF-2处理组HEC-1A细胞中p IGF-2R表达水平明显高于IGF-1处理组和对照组细胞(P<0.05),而IGF-1处理组和对照组间表达无统计学差异(P﹥0.05);IGF-1处理组HEC-1A细胞中p-PI3k和CCND1表达水平均显著高于IGF-2处理组和对照组细胞(P<0.05),而IGF-2处理组和对照组间表达无统计学差异(P﹥0.05)。2不同因子处理对HEC-1A细胞生长的影响,MTT实验结果显示:处理后1天,IGF-1处理组HEC-1A细胞生长较IGF-2处理组和对照组细胞快,但组间无统计学差异(P﹥0.05);处理后2天,IGF-1处理组HEC-1A细胞生长速度明显高于IGF-2处理组和对照组细胞(P<0.05),而IGF-2处理组细胞生长和对照组相比无统计学差异(P﹥0.05)。结论:1 IGF-1刺激增加pIGF-1R、p-PI3K和CCND1蛋白的表达,而对pIGF-2R蛋白的表达无影响;IGF-2刺激上调pIGF-1R和p IGF-2R蛋白的表达,而对p-PI3K和CCND1蛋白的表达无影响。2 IGF-1通过与IGF-1R结合,激活下游的PI3K信号通路,上调CCND1表达,促进子宫内膜癌细胞的生长。3 IGF-2作为IGF-1R的诱饵配体,使IGF-1R选择性磷酸化,但不激活IGF-1R下游的PI3K和CCND1,不促进子宫内膜癌细胞的生长。4 IGF-1促进子宫内膜癌细胞的生长,而IGF-2则对子宫内膜癌细胞的生长没有影响。5 IGF-2R不能介导IGF-2激活PI3K和CCND1。第三部分IGF-2R过表达对IGF-1调控的子宫内膜癌细胞生长及PI3K通路的影响目的:研究IGF-1和IGF-2共同作用于IGF-2R过表达的HEC-1A细胞,各种因子表达的变化,以及对HEC-1A细胞生长的影响,进一步探讨IGF-2R在EMC发病中的作用机制。方法:以IGF-2R construct转染HEC-1A细胞,使其过表达IGF-2R(IGF-2R过表达组),同时以转染错义序列作为阴性对照(SCR组);通过Western blot和MTT方法检测检测外源性同时加入IGF-1和IGF-2对IGF-2R过表达的HEC-1A细胞中p IGF-1R、pIGF-2R、pPI3K、CCND1表达的影响,以及对HEC-1A细胞生长的影响。结果:1荧光定量PCR结果所示,IGF-2R construct转染HEC-1A细胞48 h后,IGF-2R的mRNA表达明显升高,而细胞转染错义序列后IGF-2R mRNA表达没有明显改变,同时以Western blot检测IGF-2R的蛋白表达也明显升高,与荧光定量RT-PCR结果一致,证实了IGF-2R的过表达。而细胞转染错义序列后IGF-2R蛋白表达没有明显改变(P<0.05)。2 Western blot分析结果显示:IGF-1+2处理后,IGF-2R过表达组和SCR组HEC-1A细胞中pIGF-1R、pIGF-2R、p-PI3k和CCND1蛋白表达水平均较无生长因子处理组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而pIGF-1R在SCR组和IGF-2R过表达组间表达无统计学差异(P﹥0.05),IGF-2R过表达组HEC-1A细胞中pIGF-2R、p-PI3k和CCND1蛋白表达水平均显著高于SCR组(P<0.05)。这些数据表明,高水平的IGF-2R可能减少了游离的IGF-2,从而增加IGF-1R对IGF-1的敏感性。3 MTT实验结果显示,IGF-1+2处理后1天,SCR组和IGF-2R过表达组HEC-1A细胞生长均较无生长因子处理组快,组间均无统计学差异(P﹥0.05);IGF-1+2处理后2天,SCR组和IGF-2R过表达组HEC-1A细胞生长速度显著升高(P<0.05),而且IGF-2R过表达组HEC-1A细胞生长速度明显高于SCR组(P<0.05)。结论:1 IGF-1和IGF-2刺激后,无论是否存在IGF-2R过表达,HEC-1A细胞中pIGF-1R、p IGF-2R、pPI3K和CCND1蛋白的表达均升高,而且HEC-1A细胞的生长明显增快。2 IGF-2R过表达上调pIGF-2R、pPI3K和CCND1蛋白的表达,但对pIGF-1R蛋白的表达无影响,而且IGF-2R过表达明显提高了HEC-1A细胞的生长速度。3 IGF-2与IGF-1竞争性结合IGF-1R,高水平的IGF-2R减少游离的IGF-2,降低IGF-2与IGF-1的竞争作用,增强了IGF-1R对IGF-1的敏感性,从而促进下游信号通路的激活和子宫内膜癌细胞的生长。4 IGF-2R可能通过增强IGF-1R对IGF-1的敏感性,参与到IGF-1及受体IGF-1R调控的PI3K信号通路和CCND1及子宫内膜癌细胞生长。