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子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,居女性恶性肿瘤第二位,我国是子宫颈癌高发区。大量研究发现人乳头瘤病毒感染是宫颈癌发生发展的主要原因。高危型HPV病毒持续感染宫颈基底细胞,HPV基因组整合到宿主染色体中,导致HPV E6、E7高表达,HPV E2表达降低或缺失,然而这一HPV癌相关基因异常表达的分子机制尚不明确。本课题选取子宫颈鳞状细胞癌、不同病变级别的宫颈癌前病变组织及子宫颈鳞癌SiHa、Caski细胞系为研究对象,利用QT-PCR、Western Blot、基因转染及体外动物实验,初步探讨了HPV E2与E6、E7表达的相互关系及对宫颈癌细胞增殖分化相关基因的影响。首先收集子宫颈鳞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)及宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)石蜡组织105例,其中SCC 35例,CIN 70例(CIN I 26例、CINⅡ23例、CINⅢ21例),利用RT-PCR检测子宫颈鳞癌及癌前病变组织中E2、E6、E7 mRNA的表达水平。结果显示,E6、E7 mRNA随着CIN级别的升高其表达量也逐级升高,其中CINⅢ级表达水平最高,同时子宫颈鳞癌组织中E6、E7 mRNA同样呈现出高表达但与CINⅢ无明显差异;E2基因随着CIN级别的升高表达量逐渐降低,在CINⅢ与子宫颈鳞癌组织中其表达量最低且表达水平无明显差异。设计HPV16 E2特异性引物,RT-PCR扩增E2基因,构建E2基因过表达质粒pcDNA3.1-HPV16E2,采用脂质体法将HPV16 E2基因过表达质粒及对照空质粒瞬时转染至SiHa细胞,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组SiHa细胞中E2、E6、E7基因及增殖分化相关基因Ki67、p16、CyclinD1、caspase14 mRNA和蛋白表达水平。设计合成E2基因特异性siRNA干扰质粒,将干扰质粒及空质粒载体经脂质体介导分别转染至Caski细胞,实时荧光定量PCR法、Western blotting法分别检测两组Caski细胞中E2基因沉默效率、E6、E7基因及增殖周期分化相关基因Ki67、p16、CyclinD1、caspase14mRNA和蛋白表达水平。结果显示,在过表达E2基因的SiHa细胞中E6、E7基因表达量在mRNA和蛋白水平上均有明显下降,细胞周期与分化相关基因CyclinD1、caspase14表达水平升高,p16、Ki67表达水平明显下降;在沉默E2的Caski细胞中,E6、E7基因表达量在mRNA和蛋白水平上均有明显升高,细胞周期与分化相关基因CyclinD1、caspase14表达水平下降,p16、Ki67表达水平明显升高。为了进一步研究E2基因对子宫颈鳞状细胞癌增殖分化的影响,将HPV16 E2基因过表达质粒稳定转染至SiHa细胞,经G418筛选、鉴定,获得E2基因稳定过表达细胞株SiHa-E2,将空载组SiHa细胞肿瘤悬液与E2基因稳定过表达SiHa细胞肿瘤悬液分别注射在雌性BALB/c裸鼠右侧腋下,裸鼠接种肿瘤细胞后,选择每周同一时间观察裸鼠生长、饮食及接种部位肿瘤生长情况,游标卡尺测量并记录移植瘤瘤体大小(长a,宽b),计算肿瘤体积V=ab~2/2,绘制裸鼠肿瘤生长曲线,第5周处死裸鼠剥离瘤体组织拍照称重。结果发现动物模型构建成功,成瘤率100%,接种E2稳定过表达SiHa细胞和空质粒载体SiHa细胞后,肿瘤呈持续生长状态且实验组裸鼠皮下移植瘤的生长速度较对照组明显减慢,瘤体质量较对照组明显减轻。本课题初步探讨了HPV16 E2基因影响子宫颈鳞癌增殖分化的分子机制,研究表明E2基因通过调控E6、E7基因表达水平抑制子宫颈鳞癌SiHa细胞增殖,促进细胞分化;E2基因表达缺失是子宫颈鳞癌及高级别上皮内瘤变的分子特征之一,这为临床子宫颈鳞癌预防和治疗提供了新的可能靶点。