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背景:增生性瘢痕(HS)是皮肤创伤愈合过程中常见的并发症,发生率高达4~16%,严重影响组织功能恢复和外观。胶原的合成与降解代谢失衡是HS形成的根本原因,但导致胶原持续过度合成的病因学与分子机制尚不十分明确,临床上对HS的治疗是一大临床挑战。尽管采用了许多治疗方法,但其治疗效果却不尽相同。因此,需要探寻新的治疗靶点。在我们前期的研究中,基因芯片检测显示,正常皮肤(NS)组织和HS组织中micro RNA(miRNA)分子的表达存在明显差异,这些miRNA分子所调节的靶基因涵盖了细胞生命活动的多个方面,如细胞凋亡与增殖、周期与运动、合成与代谢,其中miR-29的差异最明显。而目前有研究认为,miR-29可以在转录后水平抑制胶原的合成,从而在多种纤维化疾病的发生中起重要的调控作用。但miR-29与HS形成关系的研究尚未见文献报道。因此,我们推测,持续低水平表达的miR-29丧失了对COLI基因表达的有效调控,进而导致胶原为主的细胞外基质(ECM)的过度沉积,最终形成HS。如果施用正义miR-29提高HS局部组织中miR-29表达水平,将有可能成功抑制组织的过度纤维化过程,为HS的临床防治提供新的靶点。目的:通过miRNA表达谱芯片筛选出HS组织及NS组织中显著差异表达的miRNA分子,探讨miR-29通过在转录后水平调控其靶基因COLI表达从而影响HS形成的作用机制,以期为HS的生物学治疗提供新的靶点。方法:1.收集HS组织和NS组织标本,经过HE染色后证明所取临床标本符合实验需要。分离并培养人HS及NS原代成纤维细胞。通过miRNA基因芯片筛选出HS及NS中差异表达的miRNA分子,并采用生物信息学方法预测miR-29下游靶基因。2.进一步使用荧光定量PCR方法及western blot法明确人NS与HS中miR-29c及COLI基因的差异性表达,并采用卡方检验或Fisher精确检验进行分析,探讨miR-29与COLI基因表达水平的相关性;3.构建COLI A1-3’UTR及其3种突变体的重组荧光素酶报告基因载体,分析正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞中COLI A1-3’UTR荧光素酶报告载体活性是否存在显著差异,miR-29c模拟剂是否能显著降低报告载体的活性,从而验证COLI是否为miR-29c下游的有效靶基因。4.构建和包装人miR-29c过表达腺病毒,分别转染培养的NS成纤维细胞及HS成纤维细胞,采用流式细胞分析法及CCK-8法检测HS成纤维细胞在感染腺病毒过表达miR-29c后,细胞的增殖与凋亡是否受到显著影响。结果:1.收集的HS和NS组织标本经过HE染色后均证明符合实验需要。免疫荧光染色鉴定HS组织及NS组织原代培养所得的细胞确实为成纤维细胞;2.基因芯片技术筛选发现,HS组织中miR-143、miR-32、miR-92b及miR-25等45个miRNA的表达水平与NS组织相比上调,同时miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、miR-195等68个miRNA显著表达下调,提示它们可能在HS的发生发展过程中发挥作用。其中,miR-29的改变最为显著,在12个HS样本中miR-29分子表达均显著低于NS组织(平均降低15.3倍)。3.荧光定量PCR方法对筛选出的miRNA-29在HS及NS组织中的表达情况进行检测,结果发现,无论是在组织中还是原代成纤维细胞中,miR-29c在HS中的表达显著低于NS组织。而miRNA-29家族的其他成员在HS/NS中的表达量均无显著差异。4.应用生物信息学数据库及软件对miR-29靶基因进行预测,初步推测COLI是miR-29可能的靶基因。荧光定量PCR及Western Blot检测表明COLI基因在NS组织中的表达量显著低于HS组织,COLI在HS组织及NS组织原代培养所得的成纤维细胞中的表达量与组织中表达趋势相符,卡方检验分析发现,无论在HS及NS组织中还是在原代培养的成纤维细胞中,miR-29与COLI基因表达水平均具有显著负相关性。5.构建了COLI基因及miR-29c相应结合区的突变体荧光素酶报告基因载体,酶切及测序证实构建成功。荧光素酶活性的检测结果显示:瘢痕成纤维细胞中,COLI A1-3’UTR荧光素酶报告载体活性显著高于正常成纤维细胞。在正常成纤维细胞及增生性瘢痕成纤维细胞中,miR-29c模拟剂均能有效降低COLI A1-3’UTR荧光素酶报告载体活性,却不能有效降低其突变体的荧光素酶报告载体活性。进一步说明miR-29c可直接作用于COLI A1-3’UTR从而发挥作用。6.成功构建和包装人miR-29c过表达腺病毒后,分别转染培养的NS成纤维细胞及HS成纤维细胞,采用定量PCR结合WB检测发现miR-29过表达后COLI基因表达显著受到抑制,细胞增殖实验及流式细胞分析发现miR-29过表达后成纤维细胞的增殖率显著提高而凋亡率显著下降。结论:1.基因芯片技术筛选发现,HS组织中miR-143、miR-32、miR-92b及miR-25等45个miRNA的表达水平与NS组织相比上调,同时miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、miR-195等68个miRNA显著表达下调,提示它们可能在HS的发生发展过程中发挥作用。其中,miR-29的表达差异最为显著。2.在无论是组织还是细胞,miR-29c在HS中的表达均显著低于NS,降低HS成纤维细胞中miR-29c的表达可以促进其增殖并抑制其凋亡,提示miR-29在HS的发生发展中发挥负调节作用。3.COLI基因是miR-29c直接作用的下游靶基因,miR-29对COLI基因表达发挥负调控作用,miR-29在增生性瘢痕组织中的持续性低水平表达使其对靶基因COL1表达丧失了有效的调控,造成COL1基因过表达,导致胶原为主的ECM的过度沉积,最终促进了增生性瘢痕组织的形成。miR-29c有可能成为增生性瘢痕治疗的新靶点。