鸭甲肝病毒(duckhepatitisAvirus,DHAV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)的唯一成员,其基因组为单股正链RNA,在我国流行较为普遍的是血清1型即DHAV-1。分子生物学分析表明,3D蛋白是DHAV-1基因组复制的关键酶,即 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRP),但这一分析结果尚未被实验证实。此外,对其他单股正链RNA病毒的研究表明,RdRP需要结合到病毒基因组的3’非编码区(3’untranslatedregion,3’UTR)后才能起始负链的合成,但DHAV-13D蛋白是否与3’ UTR结合及相应的结合位点仍然未知。本研究对DHAV-1 3D蛋白的RdRP活性及其在基因组3’ UTR上的结合位点进行了研究,获得如下结果:1、3D蛋白的RdRP活性鉴定对DHAV-1 H株3D蛋白进行大量诱导表达并纯化,得到了纯度、浓度均较高的可溶性的3D蛋白。将DHAV-1 H株3’ UTR与T7启动子一起克隆到pMD19-T载体中,经体外转录后获取到了大小和纯度均符合预期的DHAV-1 3’ UTR RNA。以3’ UTR RNA作为RdRP反应的模板,采用钼酸铵分光光度法和荧光定量RT-PCR方法分别检测了 3D蛋白RdRP酶促反应过程中生成的焦磷酸和RNA,发现这两种产物的量随着反应时间延长而不断上升,表明原核表达的可溶性DHAV-1 3D蛋白具有RdRP活性。2、3D蛋白与基因组3’UTR结合的研究基于DHAV-1 H株3D蛋白的氨基酸序列和3’ UTR的核苷酸序列,使用RPISeq工具对两者间的结合能力进行预测,发现DHAV-1 H株3D蛋白和3’UTR具有潜在的结合能力。采用 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)方法对纯化的 DHAV-1 3D 蛋白和 3’ UTR RNA之间的结合能力进行了鉴定。结果显示,在3D蛋白存在的情况下,凝胶中出现了迁移速率减慢的条带,而对照组未发现迁移速率减慢的条带,表明3’UTR与3D蛋白发生了结合,与预测的结果相符。3、3D蛋白在基因组3’UTR上的结合位点鉴定将3’ UTR序列划分为F1-F6这6个相互重叠的片段,并利用RPISeq工具分别对3D蛋白与各分段间的结合能力进行预测,结果显示,3D蛋白可以和除F5外的其他5个分段发生结合。将3’UTR各分段分别与T7启动子一起克隆到pMD19-T载体中,经体外转录后获取到了大小和纯度均符合预期的各分段RNA。EMSA结果表明,3’UTR的分段F3、F4和F6在凝胶中出现了迁移速率变慢的条带,表明3D蛋白在3’ UTR上的结合位点位于F3、F4和F6,即3’UTR的149-201位碱基及310-335位碱基,这与预测结果基本相符。4、靶向3D蛋白在3’UTR上结合位点的siRNA对病毒增殖的影响针对结合位点的149-201位碱基设计了两对小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),分别靶向该区域的环区和茎区,同时设计了一对与DHAV-1基因组序列无同源性的无关RNA。在转染siRNA或无关RNA后接毒DHAV-1,通过靶向病毒VP1基因的荧光定量RT-PCR对病毒拷贝数进行定量检测并以β-actin为内参对病毒VP3蛋白表达量进行Western-blot鉴定。结果显示,两对siRNA均对病毒的复制和翻译产生了不同程度的抑制作用,其中针对环区的siRNA的作用尤为明显。因此,3D蛋白在3’UTR上的结合位点(尤其是环区)对于病毒的增殖具有重要的重用。综上,DHAV-13D蛋白具有RdRP的活性,并且可与基因组3’UTR结合,其结合位点位于3’UTR的149-201位碱基以及310-335位碱基,这些结合位点对于病毒的复制和翻译均具有重要作用。研究结果为阐明3D蛋白及3’非编码区在DHAV-1复制中的作用及RNA复制的机制提供了实验数据和依据。