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背景与目的抗体药物偶联物(ADCs)作为实现肿瘤靶向治疗的重要方式,近年来得到了长足的发展。这一概念的提出最初是来源于研究者期望将抗体作为化疗药物的运输载体,减少临床使用的化疗药物因低靶向性导致的毒副作用。经历多年的研究,Kadcyla与Adcetris在临床上成功的运用证明了这一概念的可行性。一个合理的ADCs设计有三点需要考虑:抗体部分、效应分子、偶联方式。这其中抗体部分的高度靶向性是ADCs发挥作用的根本。片段抗体具有穿透性强、表达成本低等优势,但是存在靶向性低于全抗、清除率过高的缺点,限制了其实际中在临床上的运用。为了进一步提高片段抗体的靶向性,实现片段抗体运用于ADCs的构建,本实验基于实验室以往的实验成果上,在原有片段抗体anti-CD19(Fab)、融合蛋白anti-CD19(Fab)-LDP中,引入一段来自人源IgG1重链Fc段的CH3区域,期望通过CH3区域使得单体形式的融合蛋白通过彼此CH3区域之间的分子间相互作用力形成二聚化的融合蛋白,从而提高片段抗体与靶抗原的结合活性。运用Discovery Studio分子模拟软件分析由不同长度柔性肽(G4S)连接的融合蛋白的空间构象,通过基因工程技术构建并表达针对于CD19靶点的不同长度柔性肽连接的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3,并初步研究二聚化融合蛋白与靶细胞的结合活性。方法通过Discovery Studio分子模拟软件的同源建模板块模拟蛋白anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP分别与CH3通过不同长度G4S连接形成的融合蛋白的空间构象。运用PCR、overlapPCR、酶切、连接等方法,构建含有不同长度G4S的基因重组质粒 pAZY-anti-CD19(Fab)-CH3 与 pAZY-anti-CD19(Fab)-LDP-CH3,经测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌16C9进行表达,表达产物经Protein G亲和层析柱纯化后,通过12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析鉴定。采用流式细胞检测技术(FACS)检测融合蛋白与CD19+B系淋巴瘤细胞系Raji的结合活性、与亲代鼠源性抗体HIT19a竞争结合Raji细胞的活性;并运用高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)分析融合蛋白二聚体的比例。结果成功构建并表达了通过不同长度G4S连接的的融合蛋白anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)和 anti-CD 19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*),融合蛋白经 Protein G亲和层析柱纯化后在SDS-PAGE电泳以及Western blot上表现为单体形式,单体相对分子质量与预期一致。间接免疫荧光实验结果表明,通过不同长度G4S连接的融合蛋白彼此之间在与Raji细胞的结合能力方面没有明显的差异。但是与以单体形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比较,对应的二聚化的融合蛋白与Raji细胞的结合能力明显提高。此外竞争性结合实验表明,相比单体形式的anti-CD19(Fab)或者anti-CD19(Fab)-LDP,二聚化的融合蛋白与亲代鼠源性抗体HIT19a竞争结合Raji细胞的能力明显提高。结论成功通过基因工程技术构建并通过原核系统表达了不同长度G4S连接的融合蛋白 anti-CD19(Fab)-CH3(A)(B)(C)、anti-CD19(Fab)-LDP-CH3(A*)(B*)(C*)。体外实验证明,不同长度G4S连接的融合蛋白与Raji细胞结合活性没有明显差异,但是与以单体形式存在的anti-CD19(Fab)、anti-CD19(Fab)-LDP相比,二聚体形式的融合蛋白对于Raji细胞有更强的结合能力,这对于未来片段抗体药物的发展以及运用于ADCs的构建提供了新的路径。