论文部分内容阅读
本课题组通过拟南芥滞绿突变体(nye1-1)筛选和图位克隆,鉴定并克隆得到叶绿素降解代谢的关键调控基因AtNYE1。本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,在豌豆(Pisum sativum)中成功克隆了AtNYE1的同源基因PsNYE1,并对分离获得的野生型黄豌豆PsNYE1及其突变体绿豌豆Psnyel的全长cDNA进行了克隆和功能互补研究。PsNYE1的cDNA全长为1132bp,其中开放读码框(ORF)长786bp,编码261个氨基酸。有趣的是,该基因与经典遗传学理论中孟德尔观察到的豌豆黄绿子叶颜色的表型具有相关性。生物信息学分析表明,PsNYE1基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列与拟南芥叶绿素降解代谢关键调控基因AtNYE1有66％的较高相似性。为了验证PsNYE1基因的功能,将黄豌豆PsNYE1和绿豌豆Psnyel786bp的编码区序列分别构建到带有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S组成型强启动子和拟南芥衰老特异诱导型启动子SAG12的植物表达载体pGreen载体上,采用冻融法导入农杆菌,通过花序浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1。互补实验结果表明,PsNYE1基因能够异源互补拟南芥滞绿突变体nye1-1的滞绿表型,而突变体Psnyel基因不能互补。
获得可溶性的NYE1蛋白对于探索NYE1功能是至关重要的。本研究通过尝试多种方法,最终采用原核表达载体pMAL-c2X,原核表达菌株大肠杆菌RosettaPlus,通过适宜的诱导表达条件,获得了可溶性的拟南芥NYE1融合蛋白,这为进一步研究NYE1蛋白的结构功能奠定了基础。
另外,生物信息学分析发现,CRN1(_Co-_regulated with_NYE1)与NYE1具有较为相似的基因表达模式,CRN1在植物中有较高的保守性。通过对该基因T-DNA插入突变体crn1-1的研究发现,crn1-1在自然衰老和黑暗诱导衰老过程中均具有滞绿表型,在黑暗诱导衰老过程中叶片光合速率在第三天迅速下降,由此鉴定crn1-1是C类非功能型滞绿突变体。通过SDS-PAGE分析发现,Rubisco大亚基在crn1-1中的降解比在Col-O中缓慢。进一步通过Western blot分析离体叶片在黑暗处理4天后的叶绿素-蛋白复合物的降解情况发现,除Lhcbl外,其它光合作用相关蛋白如Lhcb2,L,hcb3,Lhcb4,Lhcb6,Lhca1,D2等的降解都受到了不同程度的抑制。与nye1-1中的蛋白降解相比,两者捕光蛋白复合体受抑制的情况基本一致,只存在个别细微差别。