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神经内分泌免疫调节系统是由神经、内分泌和免疫三大系统组成的多方向互作调节网络,在维持机体内稳态过程中发挥至关重要的作用。近年来高等动物研究表明,当机体受到病原侵袭时,神经递质可由神经细胞合成释放参与调节免疫应答,也可由免疫细胞自主合成,通过自分泌或旁分泌的方式发挥免疫调节作用。免疫细胞合成的神经递质在机体免疫系统的发生发育及免疫应答中的作用成为近年来的研究热点。目前在无脊椎动物中也发现了一些神经递质及其合成相关基因,但对它们在无脊椎动物免疫细胞中的分布及免疫应答响应模式等仍缺乏认识和了解。本研究以长牡蛎为研究对象,利用转录组学、分子生物学、细胞生物学和免疫学等技术手段,探究了长牡蛎血淋巴细胞中神经递质合成相关基因及其受体的表达特征、比较分析了不同神经递质对免疫刺激的响应模式及其介导的免疫调节作用,揭示了血淋巴细胞中存在多条神经递质合成途径,且这些神经递质能够差异性响应免疫刺激并发挥多重免疫调节作用,为进一步解析神经内分泌免疫系统在无脊椎动物免疫稳态维持中的作用提供参考。取得的主要研究结果如下:1 长牡蛎血淋巴细胞中存在多条神经递质合成途径,且这些神经递质合成相关基因能够动态响应LPS刺激长牡蛎血淋巴细胞中表达的基因约占基因组基因总数的59%,其中809个基因在血淋巴细胞中显著高表达,主要富集到与神经-内分泌-免疫相关通路中;其中147个基因在血淋巴细胞特异性表达,包括23个神经递质/神经肽受体或免疫识别受体,它们在血淋巴细胞的信号感知及病原识别中发挥重要作用。单胺类神经递质多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）,胆碱类神经递质乙酰胆碱（ACh）,神经肽类神经递质FMRFamide以及氨基酸类神经递质谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）的合成相关基因均在血淋巴细胞中表达。LPS刺激后,血淋巴细胞中神经递质Glu合成相关基因在6 h（前期）和12 h（中期）表达量显著升高,GABA和ACh合成相关基因表达量在24h（后期）显著升高,DA和5-HT合成相关基因主要在免疫刺激中后期表达量显著升高。2 血淋巴细胞高表达的神经递质合成酶及其受体具有保守的结构和功能特征,及鲜明的分布差异转录组和生物信息学分析筛选得到长牡蛎血淋巴细胞中高表达的NE合成酶CgDBH-1及其受体Cgα2AR,酰胺肽前体CgFMRFamide及其受体CgFMRFR-1,和乙酰胆碱合成酶CgChAT及其受体CgnAChR。分别对这些分子的序列和功能特征进行分析发现它们进化上较为保守。CgDBH-1基因编码569个氨基酸,含有9个保守的半胱氨酸残基位点及6个保守的多巴胺β羟化酶催化位点,具有催化合成NE的能力。Cgα2AR基因编码399个氨基酸,其氨基酸序列与人和小鼠的α2型ARs序列相似性最高,并与无脊椎动物α2型ARs聚为一支。CgFMRFamide基因编码432个氨基酸,含19个FMRFamide肽,CgFMRFR-1基因编码363个氨基酸,含七次跨膜结构域。CgChAh基因编码523个氨基酸并具有催化合成ACh的能力,CgnAChR基因编码276个氨基酸,含有LBD结构域。CgDBH-1、Cgα2AR、CgFMRFR-1和CgnAChR均在长牡蛎血淋巴细胞中特异性高表达,其中CgDBH-1和Cgα2AR主要分布于长牡蛎颗粒细胞,CgFMRFR-1主要分布于半颗粒细胞,CgChAT和CgnAChR主要分布于长牡蛎透明细胞。3 NE与受体Cgα2AR结合通过调控血淋巴细胞中cAMP含量介导细胞因子的表达发现长牡蛎血淋巴细胞中NE合成酶CgDBH-1和受体Cgα2AR mRNA均在LPS刺激后12 h呈现上调表达趋势。利用转染技术将Cgα2AR全长转染至HEK293T细胞,发现NE可参与调控胞内cAMP的含量,但对胞内Ca2+的含量无任何影响。通过体内干扰和抑制剂处理实验均证实Cgα2AR可促进长牡蛎血淋巴细胞中细胞因子CgIL17-5、CgTNF-1和CgTNF-2的合成。4 FMRFamide可激活p38 MAPK信号通路,参与调节长牡蛎血淋巴细胞中免疫效应分子和凋亡相关基因的表达发现长牡蛎FMRFamide前体基因CgFMRFamide和受体CgFMRFR-1均能够响应免疫刺激和干露胁迫,CgFMRFamide在LPS刺激后12 h显著上调表达,CgFMRFR-1 在LPS刺激后6-12 h表达量显著升高。CgFMRFamide与CgFMRFR-1分别于干露胁迫第3天和第6天时表达量最高。体内注射FMRFamide后,实验表明长牡蛎血淋巴细胞中p38 MAPK磷酸化水平及细胞因子CgIL17-5和凋亡相关基因CgCaspase-1和CgCaspase-3的表达量均显著上升,血清中NO的含量显著降低,同时,血淋巴中葡萄糖含量也显著增加。体内注射葡萄糖后,长牡蛎血淋巴细胞中CgFMRFamide的表达量显著下调。5 长牡蛎血淋巴细胞内ACh系统参与调节免疫致敏过程发现血淋巴细胞中乙酰胆碱合成酶CgChAT和受体CgnAChR均在LPS刺激12 h后显著下调表达,在LPS刺激48 h后显著上调表达,表明ACh系统在免疫应答后期发挥重要调节作用。长牡蛎血淋巴细胞中CgChAT和CgnAChR mRNA表达量及长牡蛎血清中ACh浓度均在灿烂弧菌连续两次刺激6 h后显著升高,暗示ACh系统参与长牡蛎免疫适应过程。综上所述,长牡蛎血淋巴细胞存在多种神经递质合成途径,且不同类型神经递质合成酶及受体呈现免疫细胞类型特异性表达特征,他们在免疫应答不同阶段也具有不同响应模式。免疫应答前中期响应的神经递质NE和FMRFamide能够通过增强免疫应答反应,快速清除病原,实现机体内稳态的恢复。而免疫应答后期响应的神经递质ACh可能主要通过抑制免疫应答反应,防止免疫过度造成机体损害,实现机体稳态的恢复。本研究成果不仅丰富了无脊椎动物免疫细胞自主合成神经递质的新功能,从进化水平完善了神经系统与免疫系统间的相互关系,同时也为从神经内分泌免疫调节系统的角度出发解析无脊椎动物免疫稳态的维持机制具有重要意义。