论文部分内容阅读
目的化学合成新型核苷类化合物β-L-D4A，鉴定正确后初步探讨其体外抗HBV作用。方法以D-谷氨酸为原料，在特定条件下，依次经过环化反应、酯化反应、还原反应、置换反应以及惰性基团保护下的构像控制反应等步骤合成β-L-D4A。经红外光谱、质谱和核磁共振谱证实目标化合物的结构。然后以2．2．15细胞培养为基础，用不同浓度的β-L-D4A进行干预后，经ELISA检测上清液中HBsAg及HBeAg的含量，提取病毒DNA后进行Southern印迹、32P标记HBV探针杂交、放射自显影，经计算机图像处理进行定量分析，求出50％抑制的药物浓度，即EC50。实验中同时以四噻唑蓝（MTT）比色分析法检测不同浓度药物的细胞毒性，求出50％细胞抑制的药物浓度，即IC50。结果经一系列步骤合成的化合物β-L-D4A经红外光谱、质谱和核磁共振谱鉴定正确；2．2．15细胞培养上清液病毒DNA的Southern印迹、自显影结果显示药物对病毒的抑制呈明显的浓度依赖性，计算出EC50为0.2μM；细胞毒性实验显示IC50为200μM。结论成功合成了β-L-D4A，体外实验显示该化合物具有明显的抑制病毒DNA复制作用，且无明显的细胞毒性，TI值为1000，高于临床应用的Lamivudine（750），将有望开发为抗HBV新物。目的研究乙肝病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在多种细胞中的表达效率，找出合适的研究药物作用靶点的细胞模型。方法用PCR分别扩增出HBV的4个启动子（含增强子），克隆到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1中，构建出HBV不同启动子调控下的EGFP基因表达载体，经酶切、测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将构建好的质粒分别转染各种细胞株，用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分别检测并分析各组细胞瞬时转染和稳定转染的效率。结果各目的片段测序正确并成功插入表达载体中，转染结果表明肝癌细胞中EGFP的表达明显高于非肝细胞，不同启动子调控下的蛋白表达量有所不同，S基因启动子介导的细胞转染效率最高。经G418筛选后，仅pEGFP-Sp和pEGFP-Xp转染的三种肝癌细胞株Huh-7、HepG2和Hep3B得到了稳定细胞克隆。结论HBV启动子调控下的外源基因在肝癌细胞中的转染效率明显高于非肝细胞，pEGFP-Sp和pEGFP-Xp稳定转染的三种肝癌细胞株Huh-7、HepG2和Hep3B以及pEGFP-Cp瞬时转染的肝癌细胞株可直接用于药物作用靶点的研究。表明肝癌细胞可能是研究HBV调控元件的最佳细胞模型，从而为下一步探索药物抗HBV具体作用靶点奠定了基础。