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植酸(肌醇六磷酸)是豆类及谷类等作物种子中磷的主要储存形式,但单胃动物(如家禽、猪等)由于体内缺乏分解植酸的酶而难以有效利的用植酸磷,大部分以植酸形式存在的磷被动物直接排出体外,造成严重的环境污染;同时,植酸磷还是一种抗营养因子,它可以和多种金属离子如Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等以及许多蛋白质螯合成相应的不溶性络合物,降低了这些营养物质的生物有效利用率以及动物对营养物质的有效利用。植酸酶(phytase),即肌醇六磷酸水解酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase,EC 3.1.3.8),是催化植酸(肌醇六磷酸)及其植酸盐水解生成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称,属于组氨酸磷酸酶家族。作为单胃动物饲料添加剂,植酸酶能有效的提高植物性饲料中磷的利用率,进而提高单胃动物对矿质元素的吸收,同时也减轻了动物排泄物中磷对环境的污染。多种微生物如细菌、酵母、丝状真菌等都能够产生植酸酶,但天然生物体中植酸酶含量极其低,难以获得大批量产品。通过基因工程技术构建的植酸酶基因工程菌即可实现植酸酶的高效异源表达,在分子水平上对植酸酶基因进行遗传操作,改善植酸酶的酶学性质如p H最适性、热温度性、催化活性等,提高其在动物体内的有效生物活性,特别是植酸酶的稳定性等,这将对植酸酶的大规模生产和应用开辟更为广阔的前景。本文将来源于Kosakonia radicincitans的植酸酶基因(Kr APPA)在Pichia pastoris表达系统高效表达了有生物活性的胞外植酸酶Kr APPAS。具体实验过程如下:首先根据Kosakonia radicincitans的植酸酶蛋白序列和毕赤酵母密码子偏爱性设计新的植酸酶基因的核苷酸序列,然后再根据此序列设计一系列的引物,用来合成这个目的基因。将合成好的基因经过大肠杆菌克隆并测序鉴定,结果显示设计的基因序列与野生型的完全一致。新的植酸酶基因与野生型基因之间的核苷酸序列比对结果显示77.7%的同源性。将测序正确的植酸酶基因Kr APPAS连接到p PIC9K表达载体上,利用电击法将基因导入到毕赤酵母GS115细胞中,然后筛选具有高活性的重组酵母转化株,甲醇诱导(浓度为1%)24h后蛋白表达量达到最高,约为45μg/ml,发酵上清液中植酸酶活性达82.27U/m L,比活性为1828.18 U/mg,从而实现了植酸酶Kr APPAS基因在Pichia pastoris中的高效分泌表达。通过硫酸铵分级沉淀和Ni离子亲和层析分离纯化出单一的植酸酶重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,其分子量约为45k Da,与生物信息学预测理论值大小相当,几乎没有糖基化现象的发生。酶学特性研究结果显示,重组植酸酶的Vmax和Km值分别为1735μmol?min-1mg-1和0.236 m M,最适p H值为3.5,最适温度为55℃,在30-65℃之间,酶相对活性都很高,温度高于60℃后,相对酶活随温度的升高逐渐降低。重组植酸酶的热稳定性比较好,在温度低于65℃时非常稳定,在65℃温育30分钟后酶活剩余90%,当温度超过70℃时,重组植酸酶的稳定性急剧下降,温育仅仅15min时酶活就只剩50%左右。Cu2+和Pb2+对重组植酸酶抑制作用较为强烈,在其终浓度仅为2 m M时,重组植酸酶的活性分别为40%和70%左右。金属离子Mg2+、Ca2+(终浓度为2 m M)对重组植酸酶有一定的激活作用,尤其是Mg2+的激活作用最为明显,可使酶活提高约15%。重组漆酶对SDS极其敏感,在2 m M终浓度处理后重组植酸酶的残余活性几乎为零。综上所述,Kosakonia radicincitans来源的植酸酶非常成功的在Pichia pastoris里高效表达,为植酸酶的结构与功能研究提供了优良的素材。本研究获得了一个具有优良性状并具有潜在商业价值的植酸酶Kr APPAS,确定为HAP植酸酶家族并且有同样的活性位点保守序列RHGXRXP。因此,本研究具有重要的理论意义和实践应用价值。