骨肉瘤为儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤,约占原发性骨恶性肿瘤的20%和恶性肿瘤的0.5%。随着新辅助化疗的应用,对于局部肢体骨肉瘤患者生存率得到明显改善,5年生存率已上升到65%-75%。但对于发生肺转移和局部复发的骨肉瘤患者预后极差,至今尚无有效方法。免疫治疗是继手术、化疗之后,治疗骨肉瘤的综合治疗手段之一。γδ T细胞是人体内固有免疫中的一个重要T细胞群；表现为CD4-CD8-"双阴性”表型,对抗原的识别无MHC限制性,无需抗原提呈细胞提呈；具有确凿的广谱杀灭肿瘤细胞功能。然而,γ,δ T细胞对骨肉瘤的作用目前研究较少。在本次研究中,我们探讨了γδ T细胞免疫治疗骨肉瘤的作用及可能涉及的途径。本次研究主要分三部分：一、首先以健康人和骨肉瘤患者外周血单个核细胞为研究对象,应用Zol和IL-2联合刺激,获得高纯度的γδ T细胞扩增。重要的是该方法获得的γδ T细胞具有细胞毒性。二、在第一部分实验的基础上,我们探索了γδ T细胞及与唑来膦酸联合抗骨肉瘤细胞的能力与途径,结果发现γδ T细胞具有抗骨肉瘤能力,并且与唑来膦酸联合效果更好。三、在裸鼠中建立骨肉瘤的动物模型,观察了γδ T细胞在动物模型中对骨肉瘤的作用。结果发现γδ T细胞具有抑制骨肉瘤增殖能力,并且与唑来膦酸联合效果更好。我们的研究结果表明,γδ T细胞具有抗骨肉瘤的作用。第一部分γδT细胞的制备及杀伤活性目的：建立外周血单个核细胞体外扩增γδ T细胞的方法。方法：不同来源的外周血单核细胞分别使用IL-2和Zol+IL-2刺激体外扩增,流式细胞技术检测γδ T细胞的纯度,以Daudi细胞作为阳性对照、Raji细胞为阴性对照,并以人成骨细胞系hFOB细胞作为正常对照,用LDH法检测扩增后γδ T细胞的细胞毒活性。结果：健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞经过体外14天的培养,Zol+IL-2组可高度选择性扩增γδ T细胞,并且扩增后γδ T细胞具有杀伤活性,而对正常细胞无杀伤活性。结论：在体外,Zol和IL-2刺激外周血单个核细胞可以高度选择性扩增γδ T细胞。第二部分γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞的体外研究目的：探讨γδ T细胞及其联合唑来膦酸在体外杀伤骨肉瘤细胞的活性及其识别和杀伤骨肉瘤细胞的途径。方法：应用LDH法检测不同来源的γδ T细胞在体外杀伤骨肉瘤细胞和唑来膦酸预处理骨肉瘤细胞的活性；以ELISA方法检测γδ T细胞和骨肉瘤细胞共培养上清中的IFN-γ;应用不同阻断剂分别阻断γδ T细胞以观察其杀伤骨肉瘤细胞的途径。结果：1.不同来源的γδ T细胞在体外对骨肉瘤细胞具有一定的杀伤活性,但来源于复发性和转移性骨肉瘤患者杀伤活性较低；唑来膦酸可显著增强γδ T细胞的杀伤作用。2.骨肉瘤细胞可刺激γδ T细胞分泌IFN-γ。3.γδ T细胞识别、杀伤Zol预处理骨肉瘤细胞主要通过TCR途径和穿孔素-溶酶途径,NKG2D途径和TRAIL途径发挥作用较小结论：γδ T细胞具有抗骨肉瘤作用。第三部分γδ T细胞的体内抑瘤实验研究目的：γδ T细胞的体内抑瘤活性。方法：裸鼠皮下注射骨肉瘤细胞建立肿瘤活体模型,动物分为对照组、单独Zol组、单独γδ T细胞组和Zol+γδT细胞联合治疗组,尾静脉注射途径接受治疗,观察肿瘤体积变化。结果：裸鼠皮下接种HOS细胞的成瘤率为93.3%,尾静脉注射γδ T细胞可以明显抑制皮下移植肿瘤的生长,并且与唑来膦酸联合抑瘤效果更好。结论：γδ T细胞可以抑制骨肉瘤的增殖。