研究背景前列腺癌在欧美国家中发病率居男性恶性肿瘤第一位[1]。但是,随着人均寿命的延长,生活方式及饮食结构的不断改变,我国的前列腺癌发病率、死亡率也不断上升。在一些经济发达地区尤为突出。以上海地区为例,在男性患者中,前列腺癌的发病率已经超过了膀胱肿瘤和肾癌,跃居男性患者恶性肿瘤第五位,位居泌尿系肿瘤第一位[2]。前列腺癌可以从局灶性病变,向局部进展期和进展期发展。目前,前列腺癌的治疗方案取决于疾病的分期,对于早期和局部进展期患者可通过根治性前列腺切除或放射治疗方法治愈。对于进展期和发生转移的前列腺癌可以用手术去势或药物去势等雄激素剥夺治疗。但是,最初18-24月大多数患者对雄激素剥夺治疗反应良好,此后,一部份患者不可避免地出现血前列腺特异抗原(Prostate specific antigen;PSA)升高、肿瘤重新生长,多处骨转移等特征[3]。此时前列腺癌转变为激素抵抗前列腺癌(Hormone refractory prostate cancer; HRPC)[4,5]。对于HRPC目前尚无理想治疗方法。因此,对于前列腺癌的发生发展,尤其是对其病程发展的研究是目前全世界的热点。大量的研究表明,细胞增殖周期的失调在肿瘤的发生发展中起着重要的作用,尤其是G1期启动的失调与肿瘤的发生发展密切相关[6]。P27蛋白是细胞周期素依赖激酶(Cyclin-dependent kinase; CDK)(?)印制因子(CDKI)家族的重要成员,具有调控细胞周期的作用,对细胞周期进行负调控[7]。P27主要通过与细胞周期素(cyclin)结合来发挥对cyclin-CDK复合物的抑制作用。P27对周期素依赖激酶(CDK)有两方面的抑制作用：一、p27能抑制已结合至(?) cyclin并被激活的CDK活性；二、p27也可以通过抑制CDK的激活过程,最终抑制细胞周期G1→S的转变。目前认为P27是一个肿瘤抑制因子,在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用。P27的抑癌作用主要通过以下途径：一、对细胞周期的负性调节作用。二、诱导细胞凋亡。三、诱导细胞分化。而大量的研究发现,在多种肿瘤组织中发现p27蛋白水平降低[8,9]。说明P27蛋白水平的下降与肿瘤的发生发展密切相关,但是其具体机制尚不清楚。p27kip1基因在恶性肿瘤中很少发生突变,且与任何遗传性肿瘤无关,但是Cave[10]等发现p27kip1基因多态性发生于第109密码子的单核苷酸转换,使氨基酸出现缬氨酸(Val)改变为甘氨酸(Gly)。这种多态性在肿瘤患者中占11%-26%,但也见于大约39%的正常人和癌旁组织。在keibel[11]等的研究中研究了p27kip1基因Val109Gly多态性与前列腺癌发病风险的相关性。96例晚期前列腺癌患者中,VV纯和子67例(70%),VG杂和子24例(25%),GG纯和子5例(5%),经统计学分析证实,p27kip1基因第109密码子多态性与晚期前列腺癌的易感性相关。VV基因型患者更易患激素抵抗型前列腺癌(OR=2.11,95%CI=1.05-4.22)。但是到目前为止,有关p27基因多态性与前列腺癌相关性研究的报道较少。目前越来越多的研究表明,人类基因组的多态性与肿瘤的发生和发展具有密切的联系。同一条基因的不同基因型在不同的肿瘤组织中可以起完全相反的作用。p27kip1作为一个重要的肿瘤抑制因子,在调控细胞周期,诱导细胞凋亡和分化中均起重要作用,因此,p27kip1的多态性很有可能影响前列腺癌的进展和预后。但是目前缺乏对p27kip1这种多态性与前列腺癌肿瘤的进展和预后相关性的研究。本课题拟通过体外实验,详细研究p27kip1基因Val109Gly多态性与前列腺癌细胞周期调控及凋亡的关系。同时通过与临床资料相结合,明确p27kip1基因Val109Gly多态性是否影响前列腺癌患者的进展和预后。第一部分人类p27基因突变体的真核表达载体构建[研究目的]为了研究p27基因Val109Gly多态性,我们利用点突变技术构建了p27基因突变体的真核表达载体质粒。[材料和方法]我们以pcDNA3.1-p27质粒为模版,设计点突变引物,采用碧云天生产的D0206基因定点突变试剂盒,根据该试剂盒protocol操作。产物测序,克隆扩增。[结果]我们成功地构建了p27突变体真核表达载体p27(G/G),该载体可在前列腺癌细胞内高效表达。将该质粒与野生型pcDNA3.1-p27(V/V)分别转染前列腺癌细胞系LNCaP细胞和PC3细胞,我们可以系统研究p27基因多态性对p27在前列腺癌细胞中功能的影响。[结论]成功构建了p27突变体真核表达载体p27(G/G)。第二部分p27基因多态性对前列腺癌细胞增殖影响的研究[研究目的]通过对转染质粒(空质粒,野生型pcDNA3.1-p27(V/V),突变型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列腺癌细胞进行增殖指标的检测,分析基因多态性对p27抗增殖效应的影响。[材料和方法]用空质粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)分别转染PC3和LNCaP(?)田胞,以空质粒组为对照组。分别在0h,24h,48h,72h时间点用MTT方法检测细胞增殖。[结果]MTT分析发现,在24h时间点,与对照组相比,野生型pcDNA3.1-p27(V/V)组与突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组对两种细胞增殖均有明显抑制作用(p<0.05)。但野生型组与突变型组之间无明显差异。在48h时间点,野生型pcDNA3.1-p27(V/V)与突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组与对照组相比存在差别(p<0.05),而且,突变型组的抑制效果强于野生型组。在72h时间点差异更明显。在PC3细胞和LNCaP细胞两者之间,结果相似,无明显差异。[结论]在48h和72h时间点突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组对前列腺癌细胞增殖的抑制作用强于野生型pcDNA3.1-p27(V/V)组。第三部分p27基因多态性对LNCap细胞周期影响的研究[研究目的]通过对转染不同质粒(空质粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列腺癌细胞进行细胞周期检测,分析p27基因多态性对前列腺癌细胞周期影响。[材料和方法]用空质粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)分别转染PC3和LNCaP细胞,在24h,72h时间点分别收集细胞,用流式细胞仪(P1染色法)检测各组细胞周期分布。用westen-blot检测周期蛋白的表达情况。[结果]在24h时间点,野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)转染组与对照组相比,G0/G1期细胞比例升高,S期和G2/M期比例相对下降,但是野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)两组无明显差异。在72h时间点,野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组与对照组相比,G0/G1期比例升高,存在差异差异(p<0.05),而野生型pcDNA3.1-p27(V/V)组突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组之间也存在显著差异。[结论]p27可使前列腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期,但是突变型pcDNA3.1-p27(G/G)比野生型pcDNA3.1-p27(V/V)阻滞效果更强。p27基因多态性对P27阻滞细胞周期的作用有影响,这种影响在LNCaP细胞和PC3细胞中无明显差异。第四部分p27基因多态性对PC3细胞凋亡及其凋亡相关蛋白影响的研究[研究目的]通过对不同时间点,转染(空质粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G))的前列腺癌细胞的细胞凋亡率及凋亡相关蛋白进行检测,分析p27基因多态性对前列腺癌细胞凋亡影响及影响凋亡的机制作初步探讨。[材料和方法]用空质粒、野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)分别转染LNCaP细胞和PC3细胞,在24h,72h时间两个时间点收集细胞。用AV+PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率。同时,用western blot方法检测各组24h,72h时间两个时间点的凋亡相关蛋白(bcl-2，bax，caspase-3, PARP)表达变化。[结果]在24h时间点,与对照组相比,野生型pcDNA3.1-p27(V/V)、突变型pcDNA3.1-p27(G/G)组均引起LNCaP和PC3细胞凋亡率均增加。72h时间点,突变型pcDNA3.1-p27(G/G)比野生型pcDNA3.1-p27(V/V)更能引起明显细胞凋亡效应。与流式细胞检测调亡率结果一致的是,突变型pcDNA3.1-p27(G/G)与野生型pcDNA3.1-p27(V/V)相比,bcl-2表达明显增加,bax表达量上升,caspase-3表达被激活。[结论]野生型pcDNA3.1-p27(V/V).突变型pcDNA3.1-p27(G/G)均可引起LNCaP和PC3细胞凋亡率增加,但是,与野生型pcDNA3.1-p27(V/V)相比,突变型pcDNA3.1-p27(G/G)更能引起细胞的凋亡,p27基因的多态性对于p27诱导细胞凋亡的能力有影响。第五部分p27基因多态性对前列腺癌患者预后的影响[研究目的]了解亚洲人群中,前列腺癌患者中p27基因多态性分布状况,p27基因多态性与前列腺癌易感性及预后的关系。[材料和方法]通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restrication fragment length polymorphism analysis,PCR-RFLP)方法,对2006年至2008年于我院接受雄激素阻断治疗的67例前列腺癌患者及50名对照患者进行p27基因型分析。通过电话随访方式,了解是否发生激素抵抗与死亡,以此判断预后。通过Fisher’s Exact test统计学方法了解p27基因多态性对前列腺癌预后的影响。[结果]统计结果显示,67例前列腺癌患者中V/V纯和型57例(85%),V/G杂合子5例(7.5%),G/G纯合子5例(7.5%)。50例对照组患者中V/V纯和型42例(84%),V/G杂合子6例(12%), G/G纯合子2例(4%)。67例前列腺癌患者中激素非抵抗型共29例,激素抵抗型38例。29例激素非抵抗型中V/V纯和型22例(76%),V/G杂合子3例(10%), G/G纯合子4例(14%)。38例激素抵抗型患者中V/V纯和型35例(92%),V/G杂合子2例(5%), G/G纯合子1例(3%)。[结论]经过统计学分析,结果显示,p27等位基因及基因型总体分布在前列腺癌患者和对照组之间无明显差异。但是,P27Val109Gly的多态性与前列腺癌发生激素抵抗相关。