目的：　　钙振荡是细胞内普遍存在的一种钙信号形式，其特征为胞浆内钙离子浓度（[Ca2+]i）周期性的升高与降低。对于同一个细胞而言，随着刺激时间的延长胞浆内钙离子浓度上升与下降的表现形式不同，即钙振荡具有不规则性。此外，同一种刺激同时作用于同一类型的不同细胞，其钙振荡的表现形式亦不同，即钙振荡具有异质性。钙振荡的这种不规则性和异质性为揭示钙振荡如何编码其下游生物学现象带来了很大困难。经过本课题组的长期思索与探讨，成功运用人工钙振荡与受体刺激相结合的研究策略，发现钙振荡频率调节受体介导激活转录的本质是依赖于累积波宽的。　　缺氧/复氧可诱导血管内皮细胞产生不规则钙振荡，该现象早在十多年前就已经发现。然而，缺氧/复氧诱导的不规则钙振荡究竟具有怎样的生理或病理生理意义，至今仍未阐明。本课题旨在探讨缺氧/复氧诱导的钙振荡调节下游转录因子NF-κB转录激活的机制，从而有望为阐明缺氧/复氧调节下游生物学效应，如血管内皮损伤等提供新线索。　　方法：　　1．RelA-GFP质粒转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后，用钙离子荧光指示剂Fura-Red孵育细胞，利用缺氧/复氧灌流控制系统交替对细胞进行灌流，同时采用共聚焦显微镜在单细胞水平同步监测RelA-GFP胞浆与核浆的荧光强度变化和胞浆钙离子浓度变化。分析每个细胞[Ca2+]i变化与所对应的转录因子NF-κB核转位强度，并利用回归分析，对钙振荡动力学参数与转录因子NF-κB核转位强度进行相关性分析。　　2．利用全自动显微灌流控制系统灌流标记有钙离子荧光指示剂Fura-2/AM的细胞，并且对钙离子的浓度变化进行实时监测利用钙离子成像检测系统，通过计算得出人工钙振荡模型的相关动力学参数，然后通过控制灌流条件，复制频率相同、累积波宽不同以及频率不同、累积波宽相同的钙振荡。　　3.群体细胞模拟不同类型的缺氧/复氧诱导的钙振荡模型后，用基于ELISA的转录因子活性检测方法检测NF-κB活性。　　结果：　　1．单细胞水平观察缺氧/复氧诱导HUVEC产生不规则钙振荡，并分析其动力学参数与转录因子NF-κB核转位的相关性。　　首先缺氧（60分钟）再复氧（50分钟）刺激转染RelA-GFP质粒的人脐静脉内皮细胞，同步监测[Ca2+]i变化与RelA-GFP荧光强度变化。本实验共观察284个细胞，其中165个细胞发生钙反应，119个细胞完全无钙反应。在发生钙反应的165个细胞中，有125个细胞发生钙振荡，而40个细胞发生一过性钙升高。首先将发生钙振荡的125个细胞的频率与所对应的RelA-GFP核转位变化百分比和荧光核质比的最大值进行相关性分析，应用polynomial回归方法分析，两者之间均无相关性（n=125，p>0.05）。而将发生钙振荡的125个细胞的累积波宽与所对应的RelA-GFP核转位变化百分比和荧光核质比的最大值采用power回归方法进行它们之间的相关性分析，发现它们之间有相关性并且也有统计学意义（n=125，p<0.05）。于是，进一步将钙振荡细胞中单个波振幅均达到转录因子NF-κB激活阈值180 nM的85个细胞的频率与所对应的RelA-GFP核转位变化百分比和荧光核质比最大值进行相关性分析，应用hyperbola回归方法分析，二者均具有相关性并且有统计学意义（n=85，p<0.05）。此外，还将发生钙振荡的125个细胞的振幅与其所对应的核转位变化的百分比之间进行了相关性分析，运用polynomial回归方法，两者有相关性且有统计学意义（n=125， p<0.05）；而其振幅与其所对应的核转位胞核与胞质比的最大值进行了相关性分析，运用power回归方法分析，二者无相关性（n=125，p>0.05）。　　2．根据缺氧/复氧刺激HUVEC诱发的钙振荡的动力学参数，人工模拟频率相同、累积波宽不同以及频率不同、累积波宽相同的钙振荡。　　对单细胞水平实验中发生钙振荡反应的125个细胞进行分析得出钙振荡的平均频率为（0.23±0.02）min-1，平均振幅为（246±9）nM，平均累积波宽为（438±50）s，最大累积波宽为1317s，振荡的平均持续时间达30 min。根据上述分析结果和理论分析预计复制以下模型（1）频率、振幅相同，累积波宽不同的钙振荡（频率0.2 min-1，振幅（246±9）nM，累积波宽分别为（438±50）s、1317s），（2）频率不同，振幅、累积波宽相同的钙振荡（频率分别为0.2 min-1、0.6 min-1，振幅（246±9）nM，累积波宽（438±50）s）。经过人工模拟，最终复制出以下模型：（1）频率、振幅相同，累积波宽不同的钙振荡（频率0.2 min-1，振幅(235.6±8) nM，累积波宽分别为（438.9±32）s、（1072±115）s）；（2）频率不同，振幅、累积波宽相同的钙振荡（频率分别为0.2 min-1、0.6 min-1，振幅（239.9±10）nM，累积波宽（440.6±86）s）。可见，通过全自动显微灌流系统可复制出与缺氧/复氧诱导的钙振荡动力学参数一致的人工不规则钙振荡模型。　　3.频率相同、累积波宽不同以及累积波宽相同而频率不同的缺氧/复氧诱导的不规则钙振荡对下游转录因子NF-κB的转录活性的影响。　　利用本实验室钙泵技术结合不规则钙振荡的模拟程序控制高钙液和零钙液交替灌流细胞30分钟。频率为0.2 min-1，累积波宽分别为（438.9±32）s、（1072±115）s时，转录因子NF-κB的活性较正常对照组升高（1.32±0.19）、（1.54±0.23），和正常对照组相比较发现是具有明显差异的（p<0.05），并且两组之间的活性的差异在统计学上也是有意义的（p<0.05， n=5-6）。累积波宽为（438.9±32）s，频率分别为0.2 min-1、0.6 min-1时，转录因子NF-κB的活性较正常对照组升高（1.32±0.19）、（1.33±0.18），和正常对照组进行比较，我们发现都很明显的升高了（p<0.05），但是两组之间的活性却没有发现差异（p>0.05，n=5-6）。　　结论：　　缺氧/复氧刺激人脐静脉内皮细胞产生非膜受体介导的不规则钙振荡，这种不规则钙振荡的频率与NF-κB核转位强度无相关性，而与累积波宽具有相关性；只有当不规则钙振荡的每单个波振幅均达到NF-κB激活阈值时，其频率和累积波宽分别与下游转录因子NF-κB的核转位强度之间都有相关性。　　缺氧/复氧诱导的非膜受体介导的不规则钙振荡在群体细胞水平实验上，当振幅、累积波宽相同，频率不同时，转录因子NF-κB的活性之间没有发现明显的差异；但是当频率、振幅相同，而累积波宽不同时，转录因子NF-κB的活性之间是发现是存在明显差异的。由以上的实验研究表明缺氧/复氧诱导的非膜受体介导的不规则无规律的钙振荡调节其下游的生物学现象的本质是累积波宽。