【背景】食管癌是一类主要起源于食管鳞状上皮和柱状上皮的恶性肿瘤,在全球致死性疾病中排名第6位[1]。尽管食管腺癌近年来有增加的趋势,但在世界上一些国家和我国仍以食管鳞癌为主[2]。食管癌确切病因尚未明确。转录因子SOX2定位于3号染色体上,以高度保守的高动力群(high-mobility group,HMG)为特征,SOX家族蛋白(包括SOX2)通过它们的HMG结构域结合特定的DNA序列激活或抑制靶基因的表达[3]。SOX2在干细胞研究、早期胚胎发生、器官形成及神经分化等重要事件中都起着关键的作用,从而引起了广泛的关注。研究表明,SOX2参与食管癌[4]、胃癌[5]、结肠癌[6]、肺癌[7]和乳腺癌[8]等多种肿瘤的发生发展。目前,SOX2在食管癌中的研究还不十分清楚。有关基因的表达调控的研究是生命科学的研究重点,通过生物信息学分析发现在SOX2的启动子区与Snail有多个结合位点,因而,我们推测是否SOX2与Snail通过相互作用参与食管鳞癌的发生发展。Snail是具有锌指结构的转录因子,可通过抑制E-cadherin的表达诱导上皮间质转化。Snail在上皮间质转分化中起重要的调节作用。为了进一步了解SOX2在食管鳞癌中的作用,我们设计此实验对SOX2与Snail在食管鳞癌中的表达相关性及其功能进行初步性探讨。【目的】1.探讨转录因子SOX2和Snail在食管鳞癌组织和细胞中的表达相关性。2.构建、鉴定SOX2的RNA干扰慢病毒载体及病毒的包装、纯化。3.初步探讨SOX2在食道鳞癌中的功能。【方法】1.免疫组织化学方法检测食管鳞癌、匹配癌旁组织及淋巴结转移癌组织中SOX2和Snail的表达,分析其与临床病理资料的相关性。2. Western blot检测SOX2和Snail在食管鳞癌细胞系EC109和EC9706中的表达。细胞免疫荧光观察SOX2和Snail在食管癌细胞中的表达及亚细胞定位。3.设计并构建两个SOX2 shRNA载体,测序鉴定正确后,利用脂质体转染293T细胞,Western blot验证干扰效率,干扰效果较好的序列构建成带GFP的SOX2 shRNA慢病毒载体并包装成慢病毒颗粒。4.通过SOX2 shRNA慢病毒感染EC109和EC9706,流式细胞仪无菌分选出GFP阳性细胞,Western blot检测SOX2表达变化。5. Wst-1法绘制生长曲线、平板克隆形成实验观察感染SOX2 shRNA病毒对食管癌细胞增殖的影响。【结果】1.SOX2和Snail在食管鳞癌组织和细胞中的表达。1) SOX2在食管鳞癌组织表达阳性率为51%(29例/57例),明显高于其匹配的癌旁组织16%(9例/57例),提示SOX2在食管鳞癌组织中表达增高(P<0.05)。另外在40例食管鳞癌及其相应的淋巴结转移癌组织中,SOX2在原发灶表达阳性率为45%(18例/45例),Snail的表达阳性率为68%(27例/40例),在转移灶中SOX2表达阳性率为28%(11例/40例),Snail为65%(26例/40例)。SOX2和Snail在食管鳞癌组织及其相应的淋巴结转移组织中表达具有正相关性(r=0.538, P<0.05)。2) SOX2和Snail的在食管鳞癌组织中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度和TNM分期等参数无显著性差异(P>0.05)。3) Western blot结果显示,SOX2和Snail均在食管癌细胞系EC109和EC9706中表达。细胞免疫荧光观察SOX2和Snail在EC109和EC9706中表达且共定位在细胞核。2.成功构建了两个SOX2 shRNA载体,测序结果正确。Western blot验证载体干涉有效,其中一个干涉效果较好的序列构建成带GFP荧光的慢病毒载体,包装纯化成慢病毒颗粒。3.进一步探讨SOX2在食管鳞癌发生与发展中的作用。1)用SOX2 shRNA慢病毒直接感染EC109和EC9706细胞,流式细胞仪分选出带GFP的阳性细胞,Western blot证实成功获得SOX2表达下调的稳定细胞系。2)免疫荧光检测感染SOX2 shRNA病毒的EC9706细胞中SOX2和Snail荧光强度均较感染阴性对照病毒的细胞减低。3) Wst-1方法检测不同感染细胞系的细胞生长状况,结果显示,下调SOX2表达的EC109和EC9706细胞生长速度减慢。4)平板克隆形成实验结果显示,感染SOX2 shRNA病毒的EC109和EC9706细胞增殖减慢,体外克隆形成能力低于对照组。【结论】1. SOX2和Snail在食管鳞癌组织、淋巴结转移癌组织和细胞中表达增高,两者表达呈正相关性,提示它们可能参与食管癌的发生与发展。2.下调SOX2的表达可抑制食管癌细胞的增殖。