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血吸虫病是危害性仅次于疟疾的一种重要热带病。本项研究探讨了特异性组分抗原和协同刺激分子表达与血吸虫致病过程中Th1/ Th2免疫偏移的相关性,阐明血吸虫感染宿主Th2优势应答的免疫学分子基础,并以协同刺激分子为靶点寻找可调控Th1/Th2极化的关键信号分子,为有效控制虫卵肉芽肿病变及肝纤维化发生发展探索新的途径,并为血吸虫病疫苗的研究策略提供新的思路。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中协同刺激分子动态变化及免疫病理应用流式细胞术观察日本血吸虫感染后4w~20w小鼠脾CD4+T淋巴细胞协同刺激分子表达水平,同时观察小鼠肝组织肉芽肿病理改变和肉芽肿细胞协同刺激分子表达水平的变化。结果发现血吸虫慢性致病过程中协同刺激分子表达谱的动态变化与虫卵肉芽肿病变密切相关。感染早期炎症剧烈,CD80、4-1BB高表达,到慢性期虫卵形成并沉积后,肉芽肿炎症显著减轻,ICOS、CD86、CD40、OX40高表达,结合前期研究结果及文献提示CD80、4-1BB主要参与介导血吸虫感染宿主体内Th1极化; ICOS、CD86、CD40、OX40高表达相关则与宿主Th2极化相关。免疫组化检测结果显示肉芽肿炎性细胞表膜协同刺激分子的表达水平随感染时间延长逐渐升高,表明虫卵肉芽肿炎性细胞表膜协同刺激分子的表达与虫卵抗原的持续性刺激相关。二、协同刺激分子在介导日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2极化中的作用收集不同病期(4~20w)感染小鼠脾淋巴细胞用SEA进行诱导培养,并采用ELISA双抗夹心法检测培养上清中Th1/Th2细胞因子表达水平和小鼠血清中IgG及其亚类IgG1、IgG2a的表达水平。离体实验结果显示感染早期(4w)Th1细胞因子IFN-γ高表达,病程由急性转为慢性时,Th1细胞因子表达下调而Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)表达水平上调;体内实验结果显示血清抗体IgG及其亚类随病程发生改变,尤其是IgG1在7w显著增高,到肉芽肿形成时后开始略有下降,但仍然处于较高水平;同时Th2分化指数及IgG1/IgG2a的比值亦随病程迁延而逐渐升高,说明宿主感染日本血吸虫后Th1免疫应答水平在急性期达高峰,随后逐渐下降,而Th2免疫应答水平逐渐上升,整体免疫应答趋势由Th1向Th2方向偏移。结合第一部分实验结果提示细胞因子和血清抗体的变化趋势与小鼠脾CD4+T淋巴细胞上协同刺激分子表达水平变化趋势相关,CD80、4-1BB主要参与介导宿主体内Th1极化;ICOS、CD86、CD40、OX40主要参与介导Th2极化反应,宿主体内免疫应答向Th2偏移。三、日本血吸虫功能性组分抗原对协同刺激分子表达谱及Th1/Th2极化的影响通过免疫印迹实验采用不同病期感染血清分析鉴定SEA(卵源性抗原)和AWA(虫源性抗原)的各组分抗原,发现不同病期感染血清所识别的SEA和AWA的组分抗原分子条带有明显的变化,SEA中的10KDa、18KDa、41KDa及47KdDa的组分蛋白和AWA中的13 KDa、37 KDa,57 KDa组分分子可被各病期(6w~20w)的血清抗体所识别,推测这4个组分蛋白可能为主要的功能性抗原,其中可能存在导致Th极化反应发生偏移的关键分子。然后用SEA(卵源性抗原)和Sj16(虫源性组分抗原)分别诱导致敏小鼠脾淋巴细胞,观察不同病期小鼠CD4+T细胞表面的协同刺激分子表达和培养上清中细胞因子的变化,结果发现SEA和Sj16均能诱导4w和7w的小鼠脾淋巴细胞高表达Th1型细胞因子(IFN-γ),感染慢性期(7w以后)小鼠脾淋巴细胞高表达Th2型细胞因子;脾CD4+T淋巴细胞表面的协同刺激分子ICOS、CD86、CD40、OX40表达水平在7w升高,尤其是ICOS和CD86的表达水平升高显著,并且在慢性期仍然维持在较高水平,表明ICOS和CD86的表达水平与Th2型细胞因子表达水平的动态变化相一致,提示ICOS、CD86、CD40、OX40呈高表达与SEA和Sj16抗原刺激相关。比较SEA和Sj16两组结果发现无显著性差异,提示SEA和Sj16均能诱导小鼠脾CD4+T淋巴细胞分泌Th2型细胞因子,使免疫应答向Th2方向偏移。结合第一、二两部分实验结果说明日本血吸虫可能存在诱导协同刺激分子ICOS、CD86高表达的组分抗原,从而导致机体免疫应答向Th2方向偏移。四、体外干预日本血吸虫感染小鼠ICOS、CD80、CD86协同刺激信号对Th1/Th2极化的影响本实验观察了anti-CD80mAb、anti-CD86mAb和anti-ICOSmAb三种阻断抗体对日本血吸虫感染小鼠不同时期(4w、7w、9w)脾淋巴细胞诱生的Th1/Th2细胞因子表达水平的影响,结果发现7w和9w时,除anti-CD80mAb处理组外, anti-CD86mAb、anti-ICOSmAb、anti-CD80mAb-anti-CD86mAb、anti-ICOSmAb- anti-CD80mAb处理组能显著降低Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达水平(p<0.01),提示干预ICOS、CD86协同刺激信号能调控Th1/Th2极化,为在血吸虫病发病过程中调控Th1/Th2极化,从而控制虫卵肉芽肿病变防止肝纤维化的发生、发展提供新的实验依据。综上所述,本项研究获得了血吸虫感染小鼠慢性致病过程中CD4+T淋巴细胞协同刺激分子动态表达特征:CD80、4-1BB主要参与介导宿主早期Th1优势应答;而虫卵肉芽肿形成时ICOS、CD86、CD40、OX40主要参与介导Th2优势应答;探讨了协同刺激分子参与介导日本血吸虫疾病过程中Th1/Th2极化的机制,发现协同刺激分子ICOS、CD86、CD40、OX40在感染后的表达动态与Th2优势应答及其小鼠病理反应相一致,特别是ICOS和CD86可能发挥重要作用;分析了Th1/Th2极化与血吸虫组分抗原的相互关系,进一步阐明了血吸虫肉芽肿病变的病理分子机制;发现干预ICOS、CD86介导的协同刺激信号可调控Th1/Th2极化,为探索以协同刺激分子为靶点调控Th1/Th2免疫偏移,寻找控制血吸虫卵肉芽肿病变防止晚期肝纤维化发生发展的有效途径及血吸虫疫苗研制策略提供实验依据和新思路。