论文部分内容阅读
眼表（角膜、结膜、副泪腺和睑板腺）、主泪腺和它们之间的神经放射环由于其密切的解剖和功能联系构成一个整体功能单位，称为“眼表泪腺反馈系统”。它们共同发挥对泪液分泌和泪膜形成的调控作用，维护眼表健康，任一环节的损害均可导致泪膜完整性和功能的破坏，从而导致干眼。干眼的发病机制比较复杂，目前认为主要与炎症、细胞凋亡、神经调节机制异常和性激素水平失调等因素相关。干眼常发生于老年女性，性激素被认为是其发病机制之一。在绝经后的妇女，内分泌变化是干眼发生的重要因素，然而是由于雌激素过剩还是不足、雄激素的缺乏和/或雌、雄激素之间的不平衡影响眼表功能尚有争议，哪些因素起主要作用仍不清楚。
细胞凋亡（apoptosis）是一种特殊的细胞死亡类型，指细胞在一定的生理或者病理条件下，遵循自身固有程序结束生命的现象。细胞凋亡是一种正常的生理现象，通过凋亡，机体清除感染和损伤，维持机体正常生理功能。然而，在一定条件下，细胞凋亡又是一种病理现象。细胞凋亡受多种信号的协同调控，其中最重要的调节细胞凋亡的因子是bcl-2和它相关的基因。细胞凋亡在免疫性疾病中起到十分重要的作用。干眼泪腺和眼表上皮细胞的凋亡异常增加，而局部组织中的淋巴细胞的凋亡却被抑制。
基质金属蛋白酶（MMPs）的表达受细胞因子、生长因子、性激素、神经激素、细胞形态改变，细胞间交互作用和细胞转化等多种因素的调节。已证实性激素在许多组织中调节MMP-2和MMP-9的合成，全身性和非全身性干燥综合症（SS）病人泪液和唾液中MMP-2和MMP-9均增加，在不同的SS鼠模型中也是如此，泪腺炎症诱导的兔干眼模型泪腺和角膜中MMP-2和MMP-9也同样升高，认为MMPs可能是本病的发病机理。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一类具有多种生物活性的细胞因子，参与调节细胞生长、分化等多种功能，是免疫系统的主要抑制性分子。TGF-β1刺激细胞外基质（ECM）如胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘蛋白和蛋白多糖的合成，抑制基质蛋白酶的产生，促进调节各种细胞连接蛋白受体的表达及ECM成分与这些受体的结合。然而关于性激素调节泪腺中MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达，以及与TGF-β1的相互关系却不清楚。以往研究表明：17β-雌二醇促进人角膜上皮细胞中促炎细胞因子和MMPs的表达，而MMPs与干眼症又有非常密切的关系。近些年，性激素在干眼中的作用逐渐引起人们的重视，成为研究的热点。
为此本实验设计了通过对雌性性成熟Wistar大鼠行双侧卵巢切除术（OVX），模拟人工绝经状态，给予大鼠雌、雄激素全身及局部治疗，观察血清雌、雄激素水平、泪液分泌量、泪膜稳定性、大鼠泪腺和眼表组织学的变化，检测泪腺中凋亡基因Bax、bcl-2、TGF-β1因子表达及MMP-2及其抑制剂TIMP-2的表达，探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及泪腺功能的影响及其作用机制，为临床医生应用雌、雄激素治疗绝经期妇女干眼提供实验依据和理论基础。本实验分为三部分。
第一部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及眼表和泪腺组织病理学和超微结构改变的影响
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及眼表和泪腺组织病理和超微结构改变的影响。
方法：雌性性成熟Wistar大鼠64只，随机分为正常对照组8只、假手术组8只、实验组48只。假手术组仅打开腹腔，切除部分脂肪，实验组行双侧OVX。术后5个月将实验组随机分为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组、实验5组、实验6组，每组8只大鼠。自术后第5个月起，实验1组不予任何干预，实验2组给予粟米油100ul皮下注射每3天一次，实验3组给予苯甲酸雌二醇200ug/kg皮下注射每3天一次，实验4组给予苯甲酸雌二醇点眼，每日4次，实验5组给予3.75mg/kg丙酸睾丸酮肌肉注射每3天一次，实验6组给予2.5％丙酸睾丸酮点眼，每日4次。分别于术前、术后第1、2、3、4、5个月及给药后6周，测大鼠泪液分泌量（SⅠt）、泪膜破裂时间（BUT）及角膜荧光素钠染色情况。给药6周后处死动物，立刻取所有大鼠泪腺、角膜和结膜，行眼表和泪腺组织病理学和透射电镜检查。分别于术前、术后第5个月及给药后6周测大鼠血清雌二醇和睾酮水平。
结论：
1.通过OVX模拟人工绝经状态，去卵巢雌鼠血清中雌、雄激素水平均较术前降低，泪液分泌减少，泪膜稳定性下降。全身补充雄激素使泪液分泌量增加，泪膜稳定性提高；全身补充雌激素使泪液分泌量减少，泪膜稳定性下降。推测OVX引起的泪液分泌减少与血清雄激素水平下降有关。
2.全身补充雄激素能够改善由于OVX术后出现的泪腺萎缩，缓解眼表损害，促进泪液分泌，改善泪膜稳定性。
3.全身补充雌激素加重泪腺萎缩及眼表损害，减少泪液分泌，破坏泪膜稳定性。提醒临床医生应慎用激素替代疗法。
第二部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中凋亡基因Bax，bcl-2表达的影响
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中凋亡基因Bax、bcl-2表达的影响。
方法：实验动物及分组同第一部分。给药6周后处死动物，立刻摘取大鼠泪腺，采用免疫组化（SP法）观察泪腺上皮细胞凋亡率及凋亡基因Bax和bcl-2的表达。
结论：正常大鼠泪腺上皮中存在Bax的表达，OVX术后泪腺上皮细胞中Bax表达增加，bcl-2表达减少，泪腺上皮细胞凋亡可能是去卵巢雌鼠泪液分泌减少的作用机制之一。全身应用雌激素加重去卵巢大鼠泪腺上皮细胞凋亡，全身应用雄激素减轻去卵巢大鼠泪腺上皮细胞凋亡。提示雄激素通过改善泪腺上皮细胞凋亡，使泪液分泌量增加，泪膜稳定性提高，眼表损害减轻；雌激素与之作用相反。
第三部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中TGF-β1、MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达及其相关性的实验研究
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中MMP-2及其抑制剂TIMP-2的表达的影响及TGF-β1的表达变化，并对TGF-β1、MMP-2及TIMP-2进行相关性分析，进一步探讨MMP-2及TIMP-2在干眼中的作用机制。
方法：实验动物及分组同第一部分。给药6周后处死动物，立刻摘取大鼠泪腺，应用RT-PCR技术检测MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平，采用Western-blot方法检测泪腺中MMP-2蛋白含量的变化，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测泪腺中TGF-β1的质量浓度。
结论：
1.OVX术后泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平较正常组增加；雌激素上调泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；雄激素下调泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；且MMP-2与TIMP-2间有相关关系。
2.OVX术后泪腺中MMP-2蛋白的表达较正常组增加；雌激素上调泪腺中MMP-2蛋白的表达；雄激素下调泪腺中MMP-2蛋白的表达。
3.雄激素促进去卵巢雌鼠泪腺中TGF-β1的表达。
4.推测雌激素通过上调泪腺中MMP-2的水平导致泪液分泌减少，泪膜稳定性下降，雄激素与之作用相反，一方面通过增加TGF-β1的含量，抑制泪腺的免疫反应，另一方面，通过抑制MMP-2的表达，改善干眼的泪液分泌功能和减缓泪腺损害。
细胞凋亡（apoptosis）是一种特殊的细胞死亡类型，指细胞在一定的生理或者病理条件下，遵循自身固有程序结束生命的现象。细胞凋亡是一种正常的生理现象，通过凋亡，机体清除感染和损伤，维持机体正常生理功能。然而，在一定条件下，细胞凋亡又是一种病理现象。细胞凋亡受多种信号的协同调控，其中最重要的调节细胞凋亡的因子是bcl-2和它相关的基因。细胞凋亡在免疫性疾病中起到十分重要的作用。干眼泪腺和眼表上皮细胞的凋亡异常增加，而局部组织中的淋巴细胞的凋亡却被抑制。
基质金属蛋白酶（MMPs）的表达受细胞因子、生长因子、性激素、神经激素、细胞形态改变，细胞间交互作用和细胞转化等多种因素的调节。已证实性激素在许多组织中调节MMP-2和MMP-9的合成，全身性和非全身性干燥综合症（SS）病人泪液和唾液中MMP-2和MMP-9均增加，在不同的SS鼠模型中也是如此，泪腺炎症诱导的兔干眼模型泪腺和角膜中MMP-2和MMP-9也同样升高，认为MMPs可能是本病的发病机理。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一类具有多种生物活性的细胞因子，参与调节细胞生长、分化等多种功能，是免疫系统的主要抑制性分子。TGF-β1刺激细胞外基质（ECM）如胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘蛋白和蛋白多糖的合成，抑制基质蛋白酶的产生，促进调节各种细胞连接蛋白受体的表达及ECM成分与这些受体的结合。然而关于性激素调节泪腺中MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达，以及与TGF-β1的相互关系却不清楚。以往研究表明：17β-雌二醇促进人角膜上皮细胞中促炎细胞因子和MMPs的表达，而MMPs与干眼症又有非常密切的关系。近些年，性激素在干眼中的作用逐渐引起人们的重视，成为研究的热点。
为此本实验设计了通过对雌性性成熟Wistar大鼠行双侧卵巢切除术（OVX），模拟人工绝经状态，给予大鼠雌、雄激素全身及局部治疗，观察血清雌、雄激素水平、泪液分泌量、泪膜稳定性、大鼠泪腺和眼表组织学的变化，检测泪腺中凋亡基因Bax、bcl-2、TGF-β1因子表达及MMP-2及其抑制剂TIMP-2的表达，探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及泪腺功能的影响及其作用机制，为临床医生应用雌、雄激素治疗绝经期妇女干眼提供实验依据和理论基础。本实验分为三部分。
第一部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及眼表和泪腺组织病理学和超微结构改变的影响
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪液分泌及眼表和泪腺组织病理和超微结构改变的影响。
方法：雌性性成熟Wistar大鼠64只，随机分为正常对照组8只、假手术组8只、实验组48只。假手术组仅打开腹腔，切除部分脂肪，实验组行双侧OVX。术后5个月将实验组随机分为实验1组、实验2组、实验3组、实验4组、实验5组、实验6组，每组8只大鼠。自术后第5个月起，实验1组不予任何干预，实验2组给予粟米油100ul皮下注射每3天一次，实验3组给予苯甲酸雌二醇200ug/kg皮下注射每3天一次，实验4组给予苯甲酸雌二醇点眼，每日4次，实验5组给予3.75mg/kg丙酸睾丸酮肌肉注射每3天一次，实验6组给予2.5％丙酸睾丸酮点眼，每日4次。分别于术前、术后第1、2、3、4、5个月及给药后6周，测大鼠泪液分泌量（SⅠt）、泪膜破裂时间（BUT）及角膜荧光素钠染色情况。给药6周后处死动物，立刻取所有大鼠泪腺、角膜和结膜，行眼表和泪腺组织病理学和透射电镜检查。分别于术前、术后第5个月及给药后6周测大鼠血清雌二醇和睾酮水平。
结论：
1.通过OVX模拟人工绝经状态，去卵巢雌鼠血清中雌、雄激素水平均较术前降低，泪液分泌减少，泪膜稳定性下降。全身补充雄激素使泪液分泌量增加，泪膜稳定性提高；全身补充雌激素使泪液分泌量减少，泪膜稳定性下降。推测OVX引起的泪液分泌减少与血清雄激素水平下降有关。
2.全身补充雄激素能够改善由于OVX术后出现的泪腺萎缩，缓解眼表损害，促进泪液分泌，改善泪膜稳定性。
3.全身补充雌激素加重泪腺萎缩及眼表损害，减少泪液分泌，破坏泪膜稳定性。提醒临床医生应慎用激素替代疗法。
第二部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中凋亡基因Bax，bcl-2表达的影响
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中凋亡基因Bax、bcl-2表达的影响。
方法：实验动物及分组同第一部分。给药6周后处死动物，立刻摘取大鼠泪腺，采用免疫组化（SP法）观察泪腺上皮细胞凋亡率及凋亡基因Bax和bcl-2的表达。
结论：正常大鼠泪腺上皮中存在Bax的表达，OVX术后泪腺上皮细胞中Bax表达增加，bcl-2表达减少，泪腺上皮细胞凋亡可能是去卵巢雌鼠泪液分泌减少的作用机制之一。全身应用雌激素加重去卵巢大鼠泪腺上皮细胞凋亡，全身应用雄激素减轻去卵巢大鼠泪腺上皮细胞凋亡。提示雄激素通过改善泪腺上皮细胞凋亡，使泪液分泌量增加，泪膜稳定性提高，眼表损害减轻；雌激素与之作用相反。
第三部分雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中TGF-β1、MMP-2及其抑制剂TIMP-2表达及其相关性的实验研究
目的：探讨雌、雄激素对去卵巢雌鼠泪腺中MMP-2及其抑制剂TIMP-2的表达的影响及TGF-β1的表达变化，并对TGF-β1、MMP-2及TIMP-2进行相关性分析，进一步探讨MMP-2及TIMP-2在干眼中的作用机制。
方法：实验动物及分组同第一部分。给药6周后处死动物，立刻摘取大鼠泪腺，应用RT-PCR技术检测MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平，采用Western-blot方法检测泪腺中MMP-2蛋白含量的变化，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测泪腺中TGF-β1的质量浓度。
结论：
1.OVX术后泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平较正常组增加；雌激素上调泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；雄激素下调泪腺中MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA水平；且MMP-2与TIMP-2间有相关关系。
2.OVX术后泪腺中MMP-2蛋白的表达较正常组增加；雌激素上调泪腺中MMP-2蛋白的表达；雄激素下调泪腺中MMP-2蛋白的表达。
3.雄激素促进去卵巢雌鼠泪腺中TGF-β1的表达。
4.推测雌激素通过上调泪腺中MMP-2的水平导致泪液分泌减少，泪膜稳定性下降，雄激素与之作用相反，一方面通过增加TGF-β1的含量，抑制泪腺的免疫反应，另一方面，通过抑制MMP-2的表达，改善干眼的泪液分泌功能和减缓泪腺损害。