花绒寄甲转录组测序及重要功能基因分析

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花绒寄甲是目前大型天牛类害虫最有效的天敌昆虫,在实验室饲养条件下其寿命能达到8年,而且能持续繁殖,为研究昆虫的长寿与繁殖提供了独一无二的资源。在过去的二十多年中,关于其形态学特性、生物学特性、对天牛的生物防治和人工繁殖的研究已很多,但是关于其基因序列和分子方面的研究还很少,而且花绒寄甲的基因组信息没有。因此,获得更多的花绒寄甲基因信息对研究其发育和繁殖的分子机制显得尤为重要。本研究利用高通量测序的方法获得了花绒寄甲的转录组信息,对拼接后的序列进行注释;分析了花绒寄甲重要的功能基因,特别是与生长发育和繁殖相关的基因,并利用实时定量PCR技术对长寿基因Methuselah(mth)进行了定量分析,研究了其表达量随龄期、虫态、存活时间的变化规律;利用RACE PCR技术对两条mth基因的全长进行了克隆,并将其与其他昆虫的相关基因进行比对和进化树分析。最后还对花绒寄甲的P450基因家族进行了分析。花绒寄甲的转录组信息为在分子水平上研究花绒寄甲长寿和持续繁殖的机理奠定了基础。主要研究结果如下:1、对花绒寄甲转录组进行了测序。本研究用花绒寄甲成虫的总RNA构建了cDNA文库,用Illumina HiSeqTM高通量测序对花绒寄甲的转录组进行了测序和从头组装。测序获得了27,543,746条纯净的序列读取片段,2,478,937,140bp核苷酸,组装成了42,810条unigene,62.23%的序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum表现出高同源性,30.43%没有与已知的基因匹配,组成了花绒寄甲的特有转录本。总共有30,103条序列(占所有unigene总数的70.32%)与nr数据库中已知的基因相匹配,这些数列中的14,280条注释到了COG数据库的25个类群中,15,704条序列注释到98,975条GO条目,22,102条unigene注释到258个KEGG通路中。2、对花绒寄甲的长寿基因mth进行了表达分析。转录组中共检索出11条mth基因,制作标准曲线后,利用实时荧光PCR研究了其中的7条序列在花绒寄甲成虫的不同组织(头、胸、中肠、后肠、精巢、卵巢、脂肪体和残体)、不同虫态(1~6龄幼虫、蛹和成虫)及不同存活时间(1,6,18,29,31,33,34和36个月)的成虫中的表达差异性,mth基因在不同的样品中均有表达,并表现出高度的组织特异性,以在精巢中的表达量为最高,接下来是残体和卵巢。不同龄期的表达分析中,以6龄幼虫的表达量最高。不同存活时间的成虫中,各mth基因的表达量无明显差异。3、对花绒寄甲的两条mth基因的全长进行了克隆。利用RACE PCR及降落式PCR技术对花绒寄甲的两条mth基因进行了全长克隆,获得了两个全长分别为2649bp和1947bp的基因序列,上传到NCBI数据库后,得到命名和序列号分别为:mth1,KM588897和mth2,KM588898。它们分别编码长度为566和409个氨基酸的蛋白质,同属于B家族G蛋白偶联受体,具有典型的7次跨膜螺旋结构。蛋白多序列比对和进化树分析的结果表明,花绒寄甲的mth1和mth2编码的蛋白都与同是鞘翅目的赤拟谷盗的同源性最高,遗传距离最近。4、对花绒寄甲转录组中的P450基因进行了家族分析。花绒寄甲转录组中共有151条P450相关的基因,比对后发现其包括了CYP4、CYP6、CYP9、CYP18和CYP301-34148家族,其中CYP6和CYP4家族的数量最多,分别占33.11%和21.19%,二者占花绒寄甲P450基因总数的一半以上。
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