乳酸菌与人类生活息息相关,作为发酵剂广泛应用于酸奶、干酪、发酵香肠、果蔬制品、酒精饮料、青贮饲料等食品或饲料加工。同时,乳酸菌也是人类和动物肠道的正常菌群,发挥着重要的益生作用,如缓解乳糖不耐症、调节肠道菌群平衡、提供营养物质、增强免疫力等。乳酸菌一般被公认为安全性菌株,研究表明,一些食源性乳酸菌中也出现了抗药性,而且是多重抗药性,甚至·些菌株携带的抗药性基因通过基因的水平转移传播到其它乳酸菌甚至致病菌中,造成了潜在的危害。另外,随着研究的深入,出现了一些关于乳酸菌的负面报道,某些菌株可能产生有害代谢物。因此,有必要对食源性乳酸菌进行安全性评价。本文从以下四个方面展开研究。1.食源性乳酸菌产有害代谢产物能力的分析首先,从原料奶、传统发酵乳、市售酸奶和药品中分离得到了36株乳酸菌。分析了这些菌株产有害代谢产物酪胺、组胺、硝基还原酶和偶氮还原酶的能力,结果发现,8株菌可以产生酪胺,3株菌可以产生组胺,所有的菌株都不产硝基还原酶和偶氮还原酶。2.食源性乳酸菌的抗生素抗性分析对36株菌的抗生素抗性进行分析。利用液体稀释法测定常见抗生素,如氯霉素、红霉素和四环素对这些菌株的最小抑制浓度,结果表明,大部分乳酸菌具有抗生素抗性,其中具有氯霉素抗性26株菌、红霉素抗性8株菌、四环素抗性11株菌,14株菌具有多重抗性,只有10株菌对所使用的抗生素都敏感。利用PCR法分析其抗性基因,结果表明,2株肠球菌携带红霉素抗性基因,1株还携带有2种四环素抗性基因tet(M)和tet(L)。另外还有2株乳杆菌携带四环素抗性基因。利用滤膜接合实验对抗性基因的转移性能进行分析。发现屎肠球菌Enterococcus faecium KN9所携带的四环素抗性不能转移到四环素敏感的肠球菌Enterococcus faecalis181中,但可以转移到乳球菌Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1614中,并得到了接合子Lactococcus lactis subsp. cremoris MGKN9。3. E.faecium KN9抗药性质粒pKN9的遗传结构分析对E. faecium KN9携带抗性基因的转移元件进行了分析。利用PCR和anchored PCR扩增转移元件的全长序列。因为受体菌L. lactis MG1614来源于L. lactis MG1363,而L. lactis MG1363的全序列已经公布,所以以接合子基因组为模板进行后续实验,当PCR扩增得到的序列与L. lactis MG1363的序列相同时,可以分析出移动元件的插入位置。经过多轮PCR,得到了约16kb的DNA片段,在这个片段两侧同时含有转座酶,序列比对分析为同一转座酶。根据转座酶相邻基因设计特异性引物,并以供体菌E. faecium KN9基因组为模板进行PCR,结果表明该转移元件为13818bp的质粒,命名为pKN9。利用ORF Finder和BLAST分析其序列,发现这个质粒含有15个ORF,其中包括2个四环素抗性基因tet(M)和tet(L)和1个链霉素抗性基因,但缺失转移基因mob。利用实时荧光定量PCR分析四环素抗性基因在不同四环素浓度时的表达情况,发现这个质粒上的四环素抗性基因tet(M)能被四环素诱导表达,而tet(L)是组成型表达。4. Lb. delbrueckii JSQM1对氯霉素的适应性抗性为了验证在抗生素选择压力下,菌株是否会出现抗药性。本研究将Lb.delbrueckii JSQM1在亚抑制浓度的氯霉素中传代培养,每100代检测一次抗生素抗性,一直到500代,然后分析其生长曲线、pH变化曲线,并利用HPLC技术分析其发酵性能。结果发现菌株在不加抗生素的培养基中培养也能通过自发突变产生抗性,但没有选择压力的情况下,抗性菌株会丢失,菌群的抗性会下降,而长期的抗生素选择压力能使菌株的抗性保持在较高水平,可见抗生素在抗性菌株的自然选择过程中发挥了重要作用。最后获得的菌株与空白对照和原始菌株相比,生长曲线、pH变化曲线没有明显变化,菌株对糖类的代谢能力和产酸能力也没有明显的变化。