论文部分内容阅读
微囊藻毒素（Microcystin,MCs）具有强烈的肝毒性,可以通过饮用水及在动植物中的积累接触人类,严重危害人类健康和生态安全。MCs家族庞大,仅目前报道出的结构类似物便有100多种,现有的免疫检测方法较难实现一次性检测出所有MCs残留,需要开发广谱性更佳的免疫检测方法。目前抗体与MCs的识别机制研究较少,尚难解答半抗原结构对抗体性能的影响及指导人工调控抗体广谱性能。实验室前期针对不同碳链长度的MCs共有结构半抗原（命名为LH和GAA）得到2株广谱性抗体。为了阐释抗体MCs广谱性识别机制,以期为抗体性能调控提供理论基础,本研究制备了高纯度的LH和GAA抗体Fab片段,并通过间接酶联免疫吸附法（icEnzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ic-ELISA）考察二者广谱特异性;运用蛋白质结晶方法,制备LH-Fab和GAA-Fab片段单体及其与代表性MCs复合物晶体,解析两株抗体与MCs的三维立体结构,并探讨影响MCs抗体广谱性的因素,取得如下主要结果:（1）建立了LH和GAA单克隆抗体酶解与纯化方法。采用木瓜蛋白酶对LH和GAA单克隆抗体进行酶解,在纯化酶解液的过程中,发现LH-Fab与凝胶过滤层析填料存在非特异性结合。利用此现象建立了LH-Fab利用凝胶过滤层析高效1步纯化方法。结合不同缓冲液p H与离子强度下LH-Fab在柱中的保留行为及其性质分析LHFab与凝胶过滤层析填料的结合机制,LH-Fab结合腔表面的强疏水性可能是引起二者结合的原因。此外建立了GAA-Fab利用Protein G和凝胶过滤层析2步纯化方法。获得的Fab片段纯度分别为94.5%,91%,回收率分别为51%,37%。（2）评价了LH和GAA抗体Fab片段的活性与广谱特异性。结果表明Fab片段相较于亲本单克隆抗体对MCs的灵敏度下降了约2-9倍,但二者均可以识别交叉反应率在36%以上的8种MCs及NOD-R,保持了较好的广谱特异性。LH-Fab对MCs灵敏度仍然高于GAA-Fab且对藻毒素保持了较一致的交叉反应率,故推测LH-Fab不识别MCs的取代位。GAA-Fab片段除MC-LW外对2号位为亮氨酸的MCs识别能力高于4号位为精氨酸的MCs,推测MCs 4位的空间位阻会使GAA-Fab的识别能力降低。（3）制备了LH-Fab单体及与MC-LR、NOD-R复合物和GAA-Fab单体及与MCLR/-LW、NOD-R复合物晶体并解析了分辨率在2.8?以下的LH-Fab-NOD-R、GAAFab、GAA-Fab-MC-LR/-NOD-R 4种晶体结构。晶体结构显示,LH-Fab和GAA-Fab结合腔深分别为12.2?、18.7?,口袋最窄处分别为7.2?、8.5?。2株抗体主要作用力是结合腔与MCs Adda片段间的疏水作用,是广谱性识别MCs的主要原因。此外LH-Fab中LCDR3-Trp97,HCDR1-Tyr32,HCDR2-Tyr49、HCDR2-Ser55,HCDR3-Ile98、HCDR3-Tyr100残基参与形成氢键和Pi-Pi堆积等相互作用,GAA-Fab中LCDR3-Lys91、LCDR3-Trp90,HCDR2-Trp47、HCDR2-Ser50、HCDR2-Tyr54、HCDR2-Tyr58,HCDR3-Arg104、HCDR3-Tyr106参与形成氢键、Pi-Pi堆积、静电作用等相互作用。GAA-Fab结合MCs时,LCDR3-Lys91、HCDR3-Arg104柔性摆动使结合腔口张开,是影响GAA-Fab结合MCs的关键氨基酸。（4）探讨了影响MCs抗体广谱性的主要因素。通过对抗体结构的分析和比较,发现LH-Fab抗体识别MCs的表位为共有基团Adda与Glu残基,不涉及取代位,因此LH-Fab对MCs和NOD-R的识别能力较一致。GAA-Fab抗体识别MCs的表位除Adda和Glu外还包括4位取代位,4位残基侧链空间位阻增大会阻碍Adda片段进入结合腔,导致结合活性降低,与配体4位残基有相互作用的HCDR2-Tyr54是影响GAA-Fab特异性的关键氨基酸。LH半抗原增加的双键结构使LH-Fab结合腔边缘疏水性大于GAA-Fab,导致LH-Fab与Adda双键的疏水结合增强,造成GAA-Fab广谱性与灵敏度低于LH-Fab。GAA-Fab复合物晶体中MC-LR和NOD-R的Adda肽键氧原子的空间取向不同,导致HCDR3-Arg104残基与NOD-R产生氢键作用结合活性增强,也是影响GAA-Fab广谱特异性的关键氨基酸。